不同年份陳皮指紋圖譜及黃酮類成分含量測定

周潔，黃海龍，余虹，高慧，李晶，葉喜德

1.撫州市臨川區人民醫院，江西 撫州 344100；2.江西中醫藥大學，江西 南昌 330004；3.江西中醫藥大學附屬醫院，江西 南昌 330006

陳皮為蕓香科植物橘Citrμs reticμlataBlanco及其栽培變種的干燥成熟果皮，藥材分為“陳皮”和“廣陳皮”（又稱新會陳皮），其中以廣陳皮為質佳。陳皮始載于《神農本草經》，味苦、辛，性溫，歸肺、脾經，可理氣健脾，燥濕化痰，常用于脘腹脹滿，食少吐泄，咳嗽痰多等癥［1］。中醫傳統理論認為陳皮“陳久者良”，如《名醫別錄》載有“橘皮療氣大勝，須陳久者良”［2］，《湯液本草》記“橘皮以色紅日久者為佳”［3］。由于成分是影響藥材質量與藥效變化的關鍵因素，而陳皮中的黃酮類、生物堿類與揮發油等是其主要有效成分［4］，這些成分變化常受貯藏、加工炮制等因素影響，不同產地或不同年限陳皮中的成分種類、含量存在差異，其功效也存在差異［5］。雖然有學者對不同年份陳皮化學成分差異進行了研究，但多以廣陳皮為研究對象［6-10］。江西省新干縣三湖鎮也是陳皮藥材主要來源，即為大紅袍，但根據該產地的陳皮研究不同年份之間的成分差異，目前文獻仍屬空白?；诖耍狙芯恳越鞯赖厮幉年惼樵牧希x擇不同貯藏年限陳皮1 d、1 年、7 年為研究對象，運用HPLC 法建立其HPLC 指紋圖譜，并對其主要成分橙皮苷、川陳皮素與橘皮素等黃酮類成分進行分析，以比較不同年份之間成分差異，并探討其變化規律，為陳皮“陳久者良”提供科學數據支撐。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1100 高效液相色譜儀（安捷倫儀器有限公司）；FA1004N 萬分之一電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；YF-111B（100 g）高速中藥粉碎機（瑞安市永歷制藥機械有限公司）；KQ-500E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TDL-80-2C 低速離心機（上海安亭科學儀器廠）；GZX-9076MBE 電熱鼓風干燥箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）。

1.2 材料

陳皮藥材產地為江西省新干縣三湖鎮，經鑒定為蕓香科植物橘（Citrus reticulataBlanco.）的干燥成熟果皮。對照品橙皮苷（批號：wks20030407）、川陳皮素（批號：wkq20031701）與橘皮素（批號：wkq20041611）質量分數均≥98%，購于四川省維克奇生物科技有限公司；乙腈、甲醇、磷酸（均為色譜純，西隴科學股份有限公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備

精密稱定適量橙皮苷、川陳皮素、橘皮素標準品粉末，加甲醇溶解，制成質量濃度為橙皮苷0.962 5 mg/mL，川陳皮素0.054 5 mg/mL，橘皮素0.034 mg/mL 的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液制備

取1 d、1 年、7 年陳皮，打粉過三號篩，精密稱定陳皮粉末約0.1 g，精密量取純甲醇25 mL，超聲提?。üβ?00 W，頻率40 kHz）40 min 后放冷，甲醇補足減失的重量，搖勻，高速離心10 min，15 000 r/min，離心后取上清液，即得供試品溶液。取1 mL 置進樣瓶備用。

2.3 色譜條件

Syncronis C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）色譜柱，柱溫35 ℃，流速1 mL/min，進樣量為5 μL，流動相為乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫為0～8 min，20%（A）；8～18 min，20%～26%（A）；18～23 min，26%～46%（A）；23～37 min，46%～52%（A）；37～39 min，52%～10%（A）。指紋圖譜檢測波長為283 nm，含量測定采用雙波長檢測，0～23 min，檢測波長283 nm；23～39 min，檢測波長330 nm。

2.4 指紋圖譜的方法學考察

2.4.1 精密度考察精密稱取1 年陳皮粉末0.1 g，按“2.2”項下方法制備，按“2.3”項下色譜條件進行測定，連續進樣6 次，以橙皮苷峰（6 號峰）為參照峰，計算特征峰的相對保留時間及相對峰面積，得相對保留時間RSD 為0.04%～0.27%，相對峰面積RSD 在0.50%～3.00%。結果顯示儀器精密度良好。

2.4.2 穩定性考察取同一供試品溶液，分別于 0、3、6、9、12、24 h 以“2.3”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，以橙皮苷峰（6 號峰）為參照峰，計算特征峰的相對保留時間及相對峰面積。相對保留時間RSD 為0.04%～0.27%，相對峰面積RSD 為0.50%～3.00%，表明供試品溶液在 24 h 內穩定。

2.4.3 重復性考察按“2.2”項下方法制備6 份供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，以橙皮苷峰（6 號峰）為參照峰，計算特征峰的相對保留時間及相對峰面積，相對保留時間RSD 為0.04%～0.22%，相對峰面積RSD 在0.74%～2.87%，結果顯示方法重復性良好。

2.5 指紋圖譜建立及相似度評價

取1 d、1 年、7 年陳皮樣品粉末，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件測定。采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件（2012.130723 版）”，以陳皮樣品0年的圖譜為參照圖譜，選擇多點校正進行匹配，生成對照特征圖譜，見圖1。將1 d、1 年、7 年陳皮供試品色譜圖與對照品指紋圖譜匹配，共確定13個共有色譜峰，進行相似度評價，結果得相似度分別為0.974、0.999、0.993，相似度均大于0.900，表明各年份陳皮的HPLC 指紋圖譜相似度較高。

圖1 不同貯存年限陳皮 HPLC指紋圖譜

圖2 陳皮對照指紋圖譜

2.6 黃酮類成分的含量測定

2.6.1 對照品溶液的制備同“2.1”項下制備。

2.6.2 供試品溶液的制備同“2.2”項下制備。

2.6.3 色譜圖色譜條件同“2.3”項下條件進行測定，對照品與供試品色譜圖見圖3。

圖3 HPLC色譜圖

2.6.4 方法學考察（1）線性關系考察。精密吸取“2.6.1”項下的混合對照品溶液，使用倍比稀釋方法，加甲醇分別稀釋2、4、8、16 和32 倍，得6份質量濃度不同的混合對照品溶液，按“2.3”項下色譜條件進行進樣測定，記錄待測成分的色譜峰面積。以峰面積為縱坐標（Y），以進樣質量濃度為橫坐標（X），進行線性回歸，計算線性回歸方程，結果顯示橙皮苷，川陳皮素和橘皮素在相應范圍內線性關系良好，R2均大于0.999 0，具體見表1。

表1 橙皮苷、川陳皮素、橘皮素的線性回歸方程

（2）精密度考察。精密稱取1 年陳皮粉末0.1 g，按“2.2”項下方法制備，并按“2.3”項下色譜條件進行進樣測定，連續進樣6 次，分別記錄峰面積，計算橙皮苷、川陳皮素和橘皮素峰面積RSD 為0.35%、0.30%、0.48%，結果顯示儀器精密度良好。（3）穩定性考察。取同一供試品溶液，分別于0、3、6、9、12、24 h 以“2.3”項下色譜條件進行進樣測定，記錄橙皮苷、川陳皮素和橘皮素成分的峰面積。計算得橙皮苷、川陳皮素和橘皮素峰面積RSD 分別為1.30%、1.49%和1.44%，表明供試品溶液在24 h 內穩定。（4）重復性考察。取同一批陳皮粉末（1 年陳皮），按“2.2”項下方法制備6 份供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進行測定，計算橙皮苷、川陳皮素和橘皮素成分含量RSD 分別為1.60 %、1.08%、1.20%，結果顯示方法重復性良好。（5）加樣回收率試驗。精密稱取已測定的1 年陳皮粉末0.05 g，共6 份，分別按供試品待測指標成分含量100%，精密加入一定量的混合對照品溶液（橙皮苷3.047 2 mg/mL，川陳皮素0.455 6 mg/mL、橘皮素0.192 6 mg/mL），按“2.3”項下的色譜條件測定指標成分含量，測定其峰面積，計算指標成分的回收率，結果見表2。

表2 橙皮苷、川陳皮素、橘皮素的加樣回收率

2.7 樣品含量測定

分別取1 d、1 年、7 年陳皮各3 份，按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.3”項下色譜條件進樣測定，計算其橙皮苷、川陳皮素、橘皮素3個指標成分的含量，結果見表3。

表3 橙皮苷、川陳皮素、橘皮素的含量測定結果（mg/g）

3 討論

3.1 提取溶劑的考察

平行稱取3 份1 年陳皮粉末0.1 g，精密稱定。分別加入50、70、100%甲醇25 mL，搖勻，超聲提取40 min，放冷后補足減失的重量，搖勻后再高速離心（15 000 r/min，10 min），取上清液，所得3份供試品溶液用HPLC 進行測定。結果顯示，以純甲醇作為提取溶劑時，其橙皮苷提取率最高；而不同濃度的提取溶劑對川陳皮素和橘皮素的提取率影響不大，故選擇純甲醇作為提取溶劑。

3.2 提取時間考察

平行稱取3 份1 年陳皮粉末0.1 g，精密稱定。各精密加入100%甲醇25 mL，搖勻，分別超聲提取20、30、40 min，放冷后補足減失的重量，搖勻后再高速離心（15 000 r/min，10 min）取上清液，所得3 份供試品溶液用HPLC 進行測定。結果顯示，不同提取時間的橙皮苷、川陳皮素、橘皮素提取率差異不大，其中提取時間為40 min 時，各指標成分含量相對較高，故選擇40 min 作為提取時間。

3.3 檢測波長的選擇

采用全波長掃描，考察不同吸收波長下各待測成分的圖譜響應強度，結果發現283 nm 檢測條件下，色譜峰較多，各峰吸收均勻，故選擇283 nm 作為指紋圖譜檢測波長，其中橙皮苷在283 nm 附近有最大吸收峰，川陳皮素和橘皮素的最大吸收波長為330 nm。故本研究依照成分吸收所在波長不同，采用了雙波長測定，選擇283 nm 為橙皮苷檢測波長，而330 nm 為川陳皮素、橘皮素檢測波長。

3.4 不同年份陳皮成分含量變化情況

采用HPLC 對1 d、1 年、7 年陳皮中的橙皮苷、川陳皮素和橘皮素含量進行測定，發現陳皮中各成分含量，隨儲存年份不同而發生變化。在所選擇的年限范圍內，橙皮苷、川陳皮素和橘皮素含量變化范圍分別為：36.680～61.770 mg/g、5.392～14.730 mg/g和2.211～6.132 mg/g。結果表明，橙皮苷含量隨年限的增長呈升高之勢，且含量相差較大；而川陳皮素與橘皮素的含量則隨年限的增長而呈下降之勢。

研究表明，陳皮所含黃酮類成分種類，受儲存年限影響甚少，但所含橙皮苷含量相差較大，且其含量隨放置時間延長而增加。由于橙皮苷為陳皮主要有效成分，故“陳久者良”之說具有一定科學依據［11-12］。也有學者認為廣陳皮中橙皮苷含量隨貯藏年限（1～19 年）延長先增加后降低，故難以得出陳皮“陳久者佳”之結論［13］；本研究選擇江西大紅袍為陳皮藥材做為考察對象，陳皮中橙皮苷含量變化與儲存時間密切相關。在考察不同年限川陳皮素、橘皮素等含量變化時，發現其含量變化與橙皮苷變化差異較大，并隨儲存年限延長而增加［14］，這與本研究結果不同。可見，通過分析不同貯藏年限陳皮中黃酮類成分含量變化差異，發現陳皮中的主要有效成分，除與受存儲年限、存儲時的條件和炮制加工等因素影響有關外，藥材來源也是影響藥材質量的主要因素［15］。雖然，存儲年限會影響陳皮主要有效成分含量，但藥效變化是否與含量變化有關，還是陳皮中多種成分變化產生的綜合作用有關，仍有待研究。