高效液相色譜法測(cè)定連花清瘟膠囊的連翹苷含量

方慧瓊，吳應(yīng)帥，肖芳紅

贛州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江西 贛州 341000

連花清瘟膠囊是由連翹、炙麻黃、金銀花、炒苦杏仁、石膏、綿馬貫眾、板藍(lán)根、大黃、魚(yú)腥草、廣藿香等13 味中藥組成，具有宣肺泄熱，清瘟解毒的功能［1］。臨床上常用于治療流行性感冒、熱毒襲肺證［2］。治療輕型、普通型新型冠狀病毒肺炎患者療效頗佳,其在控制病情進(jìn)展、改善臨床癥狀、抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)方面有一定優(yōu)勢(shì),可用于新型冠狀病毒肺炎早期防治［3-4］。目前有少量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)連翹苷的含量測(cè)定采用薄層掃描法，本文采用高效液相法測(cè)定連翹苷的含量，不僅能減少含量測(cè)定中的誤差，且能提高準(zhǔn)確度［5-6］。

1 儀器與試藥

Agilent 1260 高效液相色譜儀，配置VWD 檢測(cè)器、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、Openlab 工作站（安捷倫公司）；XSE205DU 型電子天平（梅特勒天平公司）；KQ-600KDB 高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；PURELAB Chorus 1 型超純水機(jī)（ELGA LabWate）。

連翹苷對(duì)照品（批號(hào)：110821-201816，含量：95.1%），購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，供HPLC含量測(cè)定使用；連花清瘟膠囊［批號(hào)：A1911071，A1911068，A1801264，B2001081，石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)（市售）］。

甲醇（上海振興化工一廠，批號(hào)：202003201），水為超純水（自制），乙腈（色譜純，SIGMAALDRICH 公司），磷酸（西隴科學(xué)股份有限公司，批號(hào)：171115）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Welch ultimate AQ C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.1%磷酸溶液（24∶76）為流動(dòng)相；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：205 nm；理論板數(shù)按連翹苷計(jì)不得低于3 500。

2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取連翹苷對(duì)照品適量，加50%甲醇制成每1 mL 含4 μg 的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取本品內(nèi)容物，研細(xì)，取0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 w，頻率40 kHz）20 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，量取續(xù)濾液5 mL，置25 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm 濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

精密度考察：取樣品（批號(hào)：A1911071），按“2.3”的制備方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定6 次。結(jié)果峰面積的RSD 為0.49%（n=6），表明儀器精密度良好。

線性關(guān)系考察：精密稱取連翹苷對(duì)照品0.010 95 g，置100 mL 量瓶中，加50%甲醇溶液使溶解并稀釋至刻度，作為貯備液。量取貯備液各1，2，2，10，10 mL，分 別 置100，100，50，100，50 mL 量 瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，分別制成含連翹苷為1.041，2.083，4.165，10.41，20.83 μg/mL 系列對(duì)照品溶液。精密吸取上述對(duì)照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，測(cè)得峰面積分別為88，16，354，878，1 760，以進(jìn)樣中連翹苷的量（μg）為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸方程Y＝84.449X+0.452 6（r=0.999 9）。結(jié)果表明，連翹苷進(jìn)樣量在1.041～20.82 μg 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)：A1911071），按“2.3”制備方法制備6 份，分別測(cè)定。結(jié)果RSD 為0.66%（n=6），表明重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取重復(fù)性項(xiàng)下供試品溶液于0，2，5，12，24 h 時(shí)分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定連翹苷的峰面積。面積的RSD 為0.37%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取線性關(guān)系中的對(duì)照貯備液，備用。取已知含量的樣品（批號(hào)A1911071，連翹苷含量為2.16 mg/g）約0.25 g，精密加入連翹苷對(duì)照貯備液5 mL，甲醇15 mL，按供試品溶液的處理方法處理制備成加樣回收供試品溶液，按含量測(cè)定方法測(cè)定含量。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.5 樣品含量測(cè)定

取連花清瘟膠囊內(nèi)容物0.5 g，精密稱定，按“2.3”制備溶液并進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算連翹苷的含量。樣品中連翹苷的含量見(jiàn)表2。供試品和對(duì)照品的色譜圖見(jiàn)圖1。

表2 連翹苷含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=4）

圖1 液相色譜圖：A.對(duì)照組，B.供試品。

3 討論

在本實(shí)驗(yàn)中，曾選用乙腈-水，甲醇-磷酸體系作為流動(dòng)相，乙腈-水分離效果不及乙腈-磷酸體系好；甲醇-磷酸分離效果和乙腈-磷酸效果相差不大，故使用乙腈-磷酸體系為流動(dòng)相。對(duì)Waters，月旭，炫美3 個(gè)品牌的色譜柱進(jìn)行了考察，分離效果都很好，所以此方法對(duì)色譜柱無(wú)特殊要求。2020 年版《中國(guó)藥典》采用HPLC 法測(cè)定連翹苷含量，供試品溶液的制備須經(jīng)過(guò)提取、蒸干、過(guò)柱、洗脫、濃縮至干等步驟。經(jīng)過(guò)中性氧化鋁柱層析凈化脂質(zhì)以避免其對(duì)連翹苷色譜峰的干擾，但中性氧化鋁在去除雜質(zhì)的同時(shí)，指標(biāo)成分連翹苷也因?yàn)楸晃交虿僮鞑襟E繁瑣而被損失，容易使得測(cè)得結(jié)果偏低，故在連花清瘟膠囊含量測(cè)定中,參考某些文獻(xiàn)，省去過(guò)柱步驟，減少了操作過(guò)程中的損失，結(jié)果說(shuō)明該方法快速簡(jiǎn)便、精密度高、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于連花清瘟膠囊中連翹苷的含量測(cè)定，為此類(lèi)產(chǎn)品的質(zhì)量控制作參考［7-15］。