鹽酸溴己新葡萄糖注射液無菌檢查方法研究

章瑛，張春華，劉彭浩邦，王杰，劉緒平

1.江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點實驗室江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330103

鹽酸溴己新葡萄糖注射液，適應(yīng)證為慢性支氣管炎及其他呼吸道疾病如哮喘、支氣管擴張、矽肺等有黏痰而不易咳出者。還用于術(shù)后肺部并發(fā)癥的預(yù)防治療，術(shù)前呼吸道的廓清以及早產(chǎn)兒、新生兒及嬰兒呼吸窘迫綜合征的治療，其藥理作用主要是分解痰液中的黏多糖纖維，稀釋痰液。機制是抑制杯狀細胞和黏液腺體合成糖蛋白，使痰液中酸性糖蛋白線狀網(wǎng)溶解低分子化，降低痰黏度，便于排出。促進胃黏膜反射性，引起呼吸道腺體漿液性分泌增加，恢復(fù)呼吸道分泌的正常流變，并增強氣管纖毛運動，活化纖毛運輸系統(tǒng)，廓清呼吸道［2-11］。

鹽酸溴己新葡萄糖注射液通過靜脈滴注進入血液直接起作用，根據(jù)《中國藥典》（2015 年版）規(guī)定［1］，注射劑用于靜脈注射的按照無菌制劑進行無菌檢查。為保證無菌制劑達到無菌要求，確保患者用藥安全，除了生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)、包裝等過程嚴格控制外，還需要通過對藥品進行無菌檢測后確定其是無菌才能安全出售供用。參照《中國藥典》（2015 年版）四部對于鹽酸溴己新葡萄糖注射液無菌檢查方法進行研究，建立本品的無菌檢查方法。

1 實驗儀器與培養(yǎng)基

1.1 儀器

生物安全柜 Heal Force-900C（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；細菌培養(yǎng)箱SPL-250；霉菌培養(yǎng)箱3758CN；集菌儀 HTY-2000A；全封閉無菌檢驗過濾培養(yǎng)器（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司）。

1.2 培養(yǎng)基

見表1。

表1 培養(yǎng)基信息

1.3 試驗菌株

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），CMCC（B）26003，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），CMCC（B）10104；大腸埃希菌（Escherichia coli），CMCC（B）44102；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），CMCC（B）63501，生 孢 梭 菌（Clostridium sporogenes），CMCC（B）64941，黑曲霉（Aspergillus niger），CMCC（F）98003；白色念珠菌（Candida albicans），CMCC（F）98001。菌種均來源于中國食品藥品檢定研究院。

1.4 樣品

鹽酸溴己新葡萄糖注射液（江西科倫藥業(yè)有限公司，批號：B16051102，規(guī)格：100 mL:鹽酸溴己新4 mg 與葡萄糖5 g）

2 方法

2.1 菌液的制備

分別接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌和大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，經(jīng)33 ℃培養(yǎng)24 h 后，取新鮮培養(yǎng)物用pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液10 倍稀釋，制成每1 mL 中含菌數(shù)小于100 cfu，備用。取黑曲霉接種至SDA 斜面上，經(jīng)23 ℃培養(yǎng)1 周后，取新鮮培養(yǎng)物用3～5 mL 含0.05%吐溫80 的0.9%無菌氧化鈉溶液洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子懸液1 mL，加上述稀釋劑適量稀釋，用標準比濁管比濁，其濁度與標準比濁管相當后，取1 mL 稀釋后的孢子懸液，用上述稀釋劑10 倍稀釋，制成1 mL 含孢子數(shù)小于100 cfu 的孢子懸液，備用。取白色念珠菌接種于適量的SDA 中，經(jīng)23 ℃培養(yǎng)3 d 后，取新鮮培養(yǎng)物用pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液10 倍稀釋，制成每1 mL 中含菌數(shù)小于100 cfu，備用。上述試驗菌株均為第2 代菌。

2.2 無菌方法的建立

2.2.1 預(yù)實驗 按規(guī)定量取供試品，用薄膜過濾法處理，依法檢查（《中國藥典》 2015 年版四部通則1101）選用金黃色葡萄球菌（需氧菌）、白色念珠菌（真菌）作為敏感菌株進行預(yù)試驗，結(jié)果詳見表2 和表3。

表2 金黃色葡萄球菌結(jié)果

結(jié)合上述結(jié)果表明，鹽酸溴己新葡萄糖注射液按規(guī)定量取樣，按上述薄膜過濾法，金黃色葡萄球菌及白色念珠菌均可以正常生長。經(jīng)無菌檢查方法初步驗證，本品無菌檢查可采用薄膜過濾法（不沖洗）檢驗。

2.2.2 無菌方法適用性試驗按批出廠檢驗量取樣品，先將濾器用少量0.1%無菌蛋白胨水溶液潤濕，使0.1%無菌蛋白胨水溶液順利流出，將供試品溶液濾入濾器，濾干并將硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基濾入濾器（每筒100 mL），分別加入少于100 cfu 的試驗菌，置規(guī)定溫度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～5 d 逐日觀察。同時做陽性對照試驗、陰性對照試驗、試驗菌平皿菌落記數(shù)，結(jié)果見表4和表5。

表4 菌落計數(shù)結(jié)果（cfu/mL）

表5 無菌方法適用性試驗結(jié)果

3 討論

根據(jù)2015 年版《中國藥典》四部通則中對于注射劑的要求，用于皮下注射、皮內(nèi)注射、肌內(nèi)注射、靜脈注射、靜脈滴注等途徑注入體內(nèi)的注射液均應(yīng)為無菌制劑，要求進行無菌檢查。注射劑要保證無菌，首先要在規(guī)定的無菌保證水平采取充分驗證后的滅菌生產(chǎn)工藝。在業(yè)界，常用“無菌保證水平”概念來評價滅菌工藝的效果，其定義為產(chǎn)品經(jīng)滅菌后微生物殘存的概率。該值越小，表明產(chǎn)品中微生物存在的概率越小。然而要想知道產(chǎn)品中是否還有微生物殘存，就得對此產(chǎn)品建立無菌檢查的方法，根據(jù)得出的方法對產(chǎn)品進行無菌檢查，從而判斷此產(chǎn)品是否為無菌。

結(jié)合上述的研究表明，鹽酸溴己新葡萄糖注射液幾乎無抑菌作用，在不用沖洗的情況下，各個菌株均能良好的生長。故此，鹽酸溴己新葡萄糖注射液的無菌方法為薄膜過濾法，不沖洗，此方法可行，結(jié)果可靠。