鹽酸溴己新葡萄糖注射液無菌檢查方法研究

章瑛，張春華，劉彭浩邦，王杰，劉緒平

1.江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，江西 南昌 330029；2.江西中醫藥大學，江西 南昌 330103

鹽酸溴己新葡萄糖注射液，適應證為慢性支氣管炎及其他呼吸道疾病如哮喘、支氣管擴張、矽肺等有黏痰而不易咳出者。還用于術后肺部并發癥的預防治療，術前呼吸道的廓清以及早產兒、新生兒及嬰兒呼吸窘迫綜合征的治療，其藥理作用主要是分解痰液中的黏多糖纖維，稀釋痰液。機制是抑制杯狀細胞和黏液腺體合成糖蛋白，使痰液中酸性糖蛋白線狀網溶解低分子化，降低痰黏度，便于排出。促進胃黏膜反射性，引起呼吸道腺體漿液性分泌增加，恢復呼吸道分泌的正常流變，并增強氣管纖毛運動，活化纖毛運輸系統，廓清呼吸道［2-11］。

鹽酸溴己新葡萄糖注射液通過靜脈滴注進入血液直接起作用，根據《中國藥典》（2015 年版）規定［1］，注射劑用于靜脈注射的按照無菌制劑進行無菌檢查。為保證無菌制劑達到無菌要求，確保患者用藥安全，除了生產企業在生產、包裝等過程嚴格控制外，還需要通過對藥品進行無菌檢測后確定其是無菌才能安全出售供用。參照《中國藥典》（2015 年版）四部對于鹽酸溴己新葡萄糖注射液無菌檢查方法進行研究，建立本品的無菌檢查方法。

1 實驗儀器與培養基

1.1 儀器

生物安全柜 Heal Force-900C（上海力申科學儀器有限公司）；細菌培養箱SPL-250；霉菌培養箱3758CN；集菌儀 HTY-2000A；全封閉無菌檢驗過濾培養器（杭州泰林生物技術設備有限公司）。

1.2 培養基

見表1。

表1 培養基信息

1.3 試驗菌株

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），CMCC（B）26003，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），CMCC（B）10104；大腸埃希菌（Escherichia coli），CMCC（B）44102；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），CMCC（B）63501，生 孢 梭 菌（Clostridium sporogenes），CMCC（B）64941，黑曲霉（Aspergillus niger），CMCC（F）98003；白色念珠菌（Candida albicans），CMCC（F）98001。菌種均來源于中國食品藥品檢定研究院。

1.4 樣品

鹽酸溴己新葡萄糖注射液（江西科倫藥業有限公司，批號：B16051102，規格：100 mL:鹽酸溴己新4 mg 與葡萄糖5 g）

2 方法

2.1 菌液的制備

分別接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌和大腸埃希菌的新鮮培養物至胰酪大豆胨液體培養基中，接種生孢梭菌的新鮮培養物至硫乙醇酸鹽流體培養基中，經33 ℃培養24 h 后，取新鮮培養物用pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液10 倍稀釋，制成每1 mL 中含菌數小于100 cfu，備用。取黑曲霉接種至SDA 斜面上，經23 ℃培養1 周后，取新鮮培養物用3～5 mL 含0.05%吐溫80 的0.9%無菌氧化鈉溶液洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子懸液1 mL，加上述稀釋劑適量稀釋，用標準比濁管比濁，其濁度與標準比濁管相當后，取1 mL 稀釋后的孢子懸液，用上述稀釋劑10 倍稀釋，制成1 mL 含孢子數小于100 cfu 的孢子懸液，備用。取白色念珠菌接種于適量的SDA 中，經23 ℃培養3 d 后，取新鮮培養物用pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液10 倍稀釋，制成每1 mL 中含菌數小于100 cfu，備用。上述試驗菌株均為第2 代菌。

2.2 無菌方法的建立

2.2.1 預實驗 按規定量取供試品，用薄膜過濾法處理，依法檢查（《中國藥典》 2015 年版四部通則1101）選用金黃色葡萄球菌（需氧菌）、白色念珠菌（真菌）作為敏感菌株進行預試驗，結果詳見表2 和表3。

表2 金黃色葡萄球菌結果

結合上述結果表明，鹽酸溴己新葡萄糖注射液按規定量取樣，按上述薄膜過濾法，金黃色葡萄球菌及白色念珠菌均可以正常生長。經無菌檢查方法初步驗證，本品無菌檢查可采用薄膜過濾法（不沖洗）檢驗。

2.2.2 無菌方法適用性試驗按批出廠檢驗量取樣品，先將濾器用少量0.1%無菌蛋白胨水溶液潤濕，使0.1%無菌蛋白胨水溶液順利流出，將供試品溶液濾入濾器，濾干并將硫乙醇酸鹽液體培養基或胰酪大豆胨液體培養基濾入濾器（每筒100 mL），分別加入少于100 cfu 的試驗菌，置規定溫度培養箱中培養，3～5 d 逐日觀察。同時做陽性對照試驗、陰性對照試驗、試驗菌平皿菌落記數，結果見表4和表5。

表4 菌落計數結果（cfu/mL）

表5 無菌方法適用性試驗結果

3 討論

根據2015 年版《中國藥典》四部通則中對于注射劑的要求，用于皮下注射、皮內注射、肌內注射、靜脈注射、靜脈滴注等途徑注入體內的注射液均應為無菌制劑，要求進行無菌檢查。注射劑要保證無菌，首先要在規定的無菌保證水平采取充分驗證后的滅菌生產工藝。在業界，常用“無菌保證水平”概念來評價滅菌工藝的效果，其定義為產品經滅菌后微生物殘存的概率。該值越小，表明產品中微生物存在的概率越小。然而要想知道產品中是否還有微生物殘存，就得對此產品建立無菌檢查的方法，根據得出的方法對產品進行無菌檢查，從而判斷此產品是否為無菌。

結合上述的研究表明，鹽酸溴己新葡萄糖注射液幾乎無抑菌作用，在不用沖洗的情況下，各個菌株均能良好的生長。故此，鹽酸溴己新葡萄糖注射液的無菌方法為薄膜過濾法，不沖洗，此方法可行，結果可靠。