雜交構樹根際固氮菌的分離與特性研究

張 軍，彭軼楠，郭 琪，王沛雅，李 鑫，楊 暉

(甘肅省科學院生物研究所，甘肅省微生物資源開發利用重點實驗室，“特色微生物與植物資源創新”甘肅省國際科技合作基地，甘肅 蘭州 730000)

構 樹 (Broussonetia papyrifera(Linnaeus) L’Héritier ex Ventenat)是一種具有重要經濟價值的多年生喬木，屬于桑科（Moraceae）構屬(Broussonetia)。根據Angiosperm Phylogeny Group III分類系統，又屬固氮分支[1]。近年來，新品種雜交構樹華構1號因抗逆性強、生長速度快、產量高、粗蛋白質含量高的優點，被用作優質的木本飼料來源在全國20多個省（市）推廣種植；但在甘肅等西北干旱與半干旱地區，雜交構樹的生長存在產量低、翌年返青率低等問題[2]。針對以上問題，研究人員一方面開展了選育適宜甘肅冷涼地區的高產抗寒性品系的工作；另一方面，鑒于研究表明雜交構樹高含量的粗蛋白來源和速生可能與其內生和根際共生的共生固氮或聯合固氮菌有密切關系[3]，可通過從雜交構樹根際土壤中篩選本土固氮菌微生物再回接的方式，提高菌肥效果，達到增產的目的。因此，根據土壤環境情況分離篩選雜交構樹優良固氮菌株，是研制菌肥最基礎的前期工作。本研究旨在從甘肅地區種植的雜交構樹根際分離篩選獲得固氮菌株，并對其固氮、促生、溶磷、生物防治等功能進行研究，可為進一步開發甘肅地區雜交構樹微生物氮肥提供菌種資源。

1 試驗材料

1.1 樣品

為便于研究，將根際分為遠根土(距離根部1～10 cm的土壤）、根表土（距離根部0～1 cm的土壤）與根3個部位，于2019年8月在甘肅的天水（34°5′ N，105°82′ E）、蘭州（36°0′ N，103°57′ E）和張掖（38°43′ N，100°40′ E）雜交構樹種植試驗區，按照蛇型采樣法，各取5個點分別采樣，現場混合后將根系樣品和采用四分法保留的土壤樣品裝入無菌自封袋中運回實驗室進行分離。天水、蘭州、張掖采樣區0～20 cm土層土壤的全氮含量分別為0.616、0.356、0.284 g·kg-1，硝態氮含量分別為247.00、28.80、26.05 mg·kg-1。

1.2 供試病原菌

灰霉菌（Botrytis cinereaPersoon）（Bc）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solaniKuhn）（Rs）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporumSchlecht）（Fo）、腐皮鐮孢菌（Fusarium solani(Martius) Sacco）（Fs）、茄鏈格孢（Alternaria solani(Elliset G. Martin) Sorauer）（As）由甘肅省農業科學研究院植保所提供。

2 研究方法

2.1 固氮菌的分離與培養

遠根土與根表土固氮菌的分離采用常規稀釋平板涂布法在Ashby培養基上進行。根系固氮菌的分離：取根徑約1～10 mm的根，剪成3～5 cm的段，用自來水沖洗1～2 h，在無菌操作臺中用75%酒精浸泡1 min后，無菌水洗滌3～5次，再用0.1%的升汞浸泡3 min后，無菌水洗滌3～5次，吸干表面水分，切成5～8 mm的小段，接種于Ashby培養基。28℃，恒溫培養5～7 d，待分離的菌落長出后用平板劃線法繼續在Ashby培養基上進行純化。將純化好的菌株接入LB斜面上，培養3 d后置于冰箱4℃保藏。

2.2 固氮菌的鑒定及系統發育分析

觀察菌落形態學特征。根據細菌基因組DNA提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）說明提取單菌落基因組DNA，送生物工程（上海）股份有限公司16S rDNA測序，結果與NCBI GenBank中的已知序列進行同源性比對后，判定細菌種類并劃分到屬或種。應用MEGA7.0軟件，采用鄰接法聚類分析，構建系統發育樹，Bootstrap值為1 000。

2.3 指標測定

固氮酶活性按照微生物固氮酶（NITS）ELISA試劑盒（江蘇酶免實業有限公司）說明書操作測定；溶磷能力采用定性溶磷圈法[4]和鉬銻抗定量比色法[5]測定；分泌IAA 能力采用定性顯色法和Salkowski定量比色法[5-6]測定。

2.4 固氮菌對植物病原真菌的拮抗能力

采用濾紙條法[7]研究分離到的固氮菌對植物病原真菌的拮抗能力。用LB液體培養基培養分離得到的固氮菌，待菌體濃度達到OD600= 1時，取菌液備用。在PDA培養基平板中央接種直徑為7 mm的植物病原菌菌絲塊，分別進行如下3種處理：a對照（無處理）；b無菌水濾紙條對照（距菌絲塊兩側1.5 cm位置放置用無菌水浸濕的濾紙條）；c拮抗試驗（距菌絲塊兩側1.5 cm位置放置浸濕固氮菌菌液的濾紙條）。3種處理28℃培養7～10 d，觀察抑菌效果。待處理b病原菌鋪滿整個平板時，垂直濾紙條方向測量處理b與處理c病原菌的菌落直徑，計算抑制率。抑制率 =（處理b菌落直徑-處理c菌落直徑）/處理b菌落直徑 × 100%。

2.5 菌株特性綜合評價

采用熵權法[8]對分離到菌株性能進行綜合評價。

2.6 數據處理

對獲得的數據應用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，并用Duncan氏法進行多重比較。

3 結果與分析

3.1 固氮菌菌株的分離及鑒定

經16S rDNA測序比對發現，從3個試驗區雜交構樹根際共分離到10株固氮菌，有5株菌為3地共有，分屬同1菌株（表1）。與該屬模式菌株及最高相似性菌株的16S rDNA基因序列構建的系統發育樹（圖1）表明：10株菌分屬8個屬9個種，其中，3地共有菌HTZ1、HTZ2、HTZ3、HTZ4、HTZ5分別被認定為根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens(Smith et Townsend) Conn）（同源相似性98.16%，下同）、費氏中華根瘤菌(Sinorhizobium fredii(Scholla et Elkan) Chen）(99.82%)、阿拉伯分枝桿菌（Mycolicibacterium arabienseZhang）（98.88%）、墨西哥假黃單胞菌（Pseudoxanthomonas mexicanaThierry）（97.87%）和日本假黃單胞菌（Pseudoxanthomonas japonensisThierry）（98.13%）。從天水試驗區遠根土中另外分離得到的2株菌TS2、TS4，分屬纖維弧菌屬（Cellvibrio）和固氮菌屬（Azotobacter），被認定為Cellvibrio fibrivoransMergaert（98.17%）和圓褐固氮菌（Azotobacter chroococcumBeijerinck）（99.73%）。從蘭州遠根土和根表土中另外分離得到的2株菌HP5、HP10分屬腸桿菌屬（Enterobacter）和鞘氨醇桿菌屬（Sphingobium），被認定為煙草腸桿菌（Enterobacter tabaciDuan）（99.53%）和Sphingobium abikonenseKumari（98.70%）。從張掖遠根土中分離得的ZY9也屬于假黃單胞菌屬（Pseudoxanthomonassp.）（99.38%）。以上菌株在雜交構樹根際的分布數量表現為根表土 ＞ 遠根土，菌株種類數量最多的為假黃單胞菌屬，共3株，優勢率為37.5%。3個試驗區雜交構樹的根內均未分離得到固氮菌。

圖1 基于16S rDNA基因序列構建的10株雜交構樹根際固氮菌株系統發育樹Fig.1 Phylogenetic trees of nitrogen fixing strains from rhizosphere constructed based on 16S rDNA gene sequence

表1 雜交構樹根際固氮菌分離結果與菌落形態Table 1 Results and colony morphology of root-bound nitrogen-fixing bacteria from hybrid Broussonetia papyrifera

3.2 固氮、溶磷、促生、生防特性及綜合評價

表2表明：分離得到的10株固氮菌固氮酶活性存在差異，其中，HTZ4的固氮酶活性最低（130.41 IU·L-1），TS4的活性最高（184.51 IU·L-1）。所有固氮菌均無溶解無機磷的能力，僅HTZ2和TS4在蒙金娜有機磷培養上出現溶磷圈，說明這2株菌具有一定溶解有機磷（卵磷脂）的能力（圖2、表2），但二者差異不顯著，而在發酵液中有機磷的增量表現為TS4顯著大于HTZ2。能夠分泌IAA的固氮菌有8株，占分離獲得菌株數量的80%。HTZ4和HTZ1產IAA顯色反應最明顯，說明具有較強的分泌IAA的能力，分泌量分別達44.62、36.52 μg·mL-1，與其他菌株差異極顯著；HTZ4菌液IAA的分泌量比HP10的高出約20倍（表2）。

表2 固氮菌固氮酶活性、溶磷和產IAA能力的檢測結果Table 2 Results of activity, dissolved phosphorus and IAA production capacity of nitrogen-fixing bacteria

圖2 菌株HTZ2（A）和TS4（B）在蒙金娜有機磷培養基上的解磷能力Fig.2 Phosphorolysis ability of strains HTZ2（A）and TS4（B）on Montana organophosphate medium

10株固氮菌對不同植物病原菌的拮抗作用不同（表3、圖3、4）。所有菌株對Bc均無拮抗作用，除HTZ2、TS4和TS2對另外4種供試病原菌也無抑制效果或效果微弱外，其余7株菌分別對至少2種以上病原菌有一定的抑制作用，其中，HP5、HP10、HTZ4、ZY9對As、Fs、Fo均有拮抗作用，HTZ4、HP5分別對As、Fs的抑菌率最大，分別為50.00%、47.37%，其次為HP10，對As、Fs抑制率分別為45.83%、44.44%；HP5、ZY9對Rs也有拮抗作用。

圖3 HP5菌株與部分病原菌的拮抗試驗結果Fig.3 Antagonistic test results of the HP5 strain against some pathogenic fungi

表3 固氮菌與植物病原菌的拮抗作用Table 3 Results of antagonism between nitrogen-fixing bacteria and plant pathogenic fungi

通過對分離得到的10株固氮菌進行固氮、溶磷、分泌生長素、抑菌特性測試結果表明：各菌株對不同測試指標表現各異，其中，TS4、HTZ2 具有固氮、溶磷、分泌IAA的能力，但不具備抑制供試病原菌的能力；HP5、HTZ4、HTZ5、ZY9、HP10除無溶磷能力外，具有不同程度的固氮、分泌IAA、抑制病原菌Fs、As、Fo、Rs的作用，而TS2具有較強的固氮能力。為此，對10株固氮菌的上述4個特性進行了綜合評價（表4），排名前5位的菌株為TS4、HP5、ZY9、HTZ4和HTZ5。

表4 固氮菌特性綜合評價結果Table 4 Comprehensive evaluation results of nitrogen-fixing bacteria characteristics

圖4 HP10菌株與部分病原菌的拮抗試驗結果Fig.4 Antagonistic test results of the HP10 strain against some pathogenic fungi

4 討論

聯合固氮菌不同于具有專一宿主植物（如豆科）的共生固氮菌（如根瘤菌），大多聚集在植物根表而在自然生態系統中廣泛存在[9]，除具有固氮能力外，還可通過分泌生長激素、溶磷、增強抗病性和抗逆性等間接作用促進植物生長[10]。目前，利用聯合固氮菌調控植物微生態環境已應用在玉米[11]、甘蔗[12]等作物上，其生態和經濟效益潛力前景廣闊。本研究對雜交構樹根際聯合固氮菌的分離屬首次。從甘肅3個雜交構樹種植試驗區共分離到分屬8個屬的固氮菌，以假黃單胞菌屬居多，與通過高通量測序得出構樹根際微生物以假單胞菌屬數量最多的結果不一致[3]，這可能與雜交構樹生長年限和取材地域的差異有關。分離得到的固氮菌菌株在根際的分布數量表現為根表土 ＞ 遠根土 ＞ 根，這一規律與從玉米和禾草根際分離促生菌[13-14]得到的結果一致；但3地根中沒有分離到固氮菌，又與前二者能夠在根中獲得菌株不一致，這可能與各自的繁殖方式不同有關，前二者主要進行種子繁殖，存在一定內源微生物，雜交構樹為無性繁殖組培苗，受微生物侵染的幾率較小，煉苗后移植大田的種植年限也較短（3地種植期均為2 a）。另外，黃酮類化合物是雜交構樹的主要藥用成分，也是微生物向雜交構樹根際定殖的重要信號物質[3]，幼齡期雜交構樹根中黃酮類物質的積累明顯不足，有可能造成微生物向根表移動而尚未侵入內根際；但也不能排除分離方法的局限性是根內未分離出菌株的原因之一。上述推測需后續開展試驗進一步證實。

本研究中，5株3地共有菌均來自根表土，說明離雜交構樹根系較近土壤中的微生物種類可能只與根中信號傳導物質有關；而3地特有種，除HP10以外均來自遠根土，說明較遠土壤中的微生物種類可能受3地氣候、土壤理化性質、類型及耕作措施等因素的影響較大。有研究表明，土壤含氮量是影響植物固氮菌種類和數量的重要因素[15-16]，高水平的氮素不利于固氮菌菌群的生長。本研究中，從天水試驗區根際土壤中獲得的固氮菌種類與數量并未因土壤中全氮和硝態氮水平與蘭州、張掖試驗區差異較大而呈明顯差異，差異僅表現為特有種，可能原因是3地試驗區土壤含氮量整體偏低而不足以產生“氮阻遏”效應。雜交構樹根部雖不形成根瘤，但從根際分離到了根瘤菌，說明根瘤菌也可定殖于非豆科植物根際固氮[17]。

從菌株特性看，本研究中固氮、溶磷、分泌IAA和抑制植物病原菌能力較強的菌株在屬種的分布無較強規律性，具有一定的普遍性，且大多分離自根表土，離根系較近，表明這些菌株的活性與雜交構樹根際分泌物的相互作用也有一定相關性[18]。本研究應用熵權法篩選出了綜合性能較強的5株固氮菌，但排名靠后的菌株在某些特性方面的表現也較優異，如鞘氨醇桿菌屬菌株HP10，在本研究中表現為較高的固氮酶活性和抑制腐皮鐮孢菌、茄鏈格孢的能力，該屬菌株在降解芳香族化合物、耐鹽堿、青貯中蛋白水解[19-21]等方面都有應用，具有多種生物學功能。因此，可進一步發掘其應用范圍或研究與其他菌株的聯合應用。另外，雜交構樹抗逆性強，耐鹽堿[22]，后續可在鹽堿地種植的雜交構樹根際發掘耐鹽、耐堿固氮菌株。

5 結論

從甘肅境內3個種植區的雜交構樹根際分離獲得10株固氮菌，并分析了其固氮、溶磷、分泌IAA和抑制植物病原菌的特性，為西北半干旱地區雜交構樹根際微生物深入研發與利用奠定了基礎。