紅樺組織培養(yǎng)體系的建立

付雪寧，高洪治，申耀榮，王永康，姜在民，蔡 靖＊

(1. 西北農林科技大學林學院，陜西 楊凌 712100；2. 甘肅省小隴山林業(yè)實驗局洮坪林場，甘肅 隴南 742200；3. 陜西省寶雞市馬頭灘林業(yè)局，陜西 寶雞 721006；4. 西北農林科技大學生命科學學院，陜西 楊凌 712100)

紅樺（Betula albo-sinensisBurk.）是樺木科樺木屬樹種，為我國特有種，分布于陜西、甘肅、寧夏、青海、云南、四川、湖北、河北、河南、山西等地，垂直分布海拔為1 000～3 400 m。樹高可達30 m，樹皮為淡紅褐色或紫紅色，呈薄層狀剝落，剝落樹皮為紙質[1]。

紅樺枝干挺拔，顏色亮麗，觀賞價值高，可用于園林綠化；其獨特的紙質樹皮可用于工藝品制作以及包裝行業(yè)，具有較高的經濟價值；其木材質地堅韌，結構細密，可作優(yōu)良的板材；適應能力強，亦可用做荒山造林樹種，是我國北方高海拔地區(qū)重要的先鋒造林樹種，也是高山主要成林樹種[2]。但由于20世紀70～80年代的大量砍伐，紅樺原始林遭到了嚴重破壞，采伐后恢復起來的次生林，林分密度過大、質量不高，生產力低，各種生態(tài)和社會服務功能沒有得到有效發(fā)揮，且紅樺種子天然萌發(fā)對光照和晝夜溫差要求較高，種子更新困難[3]，因此，建立簡單高效的紅樺再生體系具有重要意義。

國外在樺樹組織培養(yǎng)方面先后建立了紙樺（B.papyriferaMarshall）[4]、日本白樺（B. platyphyllavar.Japonica）[5]、垂枝樺（B.pendulaRoth.）[6]等樺樹的組培再生體系；我國從20世紀70年代開始，亦已進行了白樺（B. platyphyllaSuk.）[7]、光皮樺（B. luminiferaH.Wink.）[8]、西南樺（B. alnoidesBuch Ham.ex D.Don）[9]、裂葉垂枝樺[10]等樺木組織培養(yǎng)體系研究。

由于國內對于紅樺組織培養(yǎng)方面的研究尚無，故本研究通過器官發(fā)生途徑建立高效穩(wěn)定的紅樺組織培養(yǎng)技術體系，以期為紅樺良種選育、定向培育及遺傳轉化等方面的研究提供理論支持，為高海拔地區(qū)荒山紅樺造林提供技術支持，同時也可填補紅樺無性繁殖研究方面的空白。

1 材料與方法

1.1 試驗材料的獲得及預處理

分別于2017年冬季至2018年早春在陜西省寧陜縣火地塘林場，采集生長健壯、無病蟲害的紅樺帶休眠芽枝條，選取飽滿休眠芽，剝去外層芽鱗，剩余內部長約0.5 cm的芽尖，基部連帶1～2 mm長的莖段，置于大燒杯中，用紗布封口后，自來水沖洗1～2 h。

1.2 試驗方法

1.2.1 0.1%HgCl2滅菌時間對無菌外植體獲得的影響 將休眠芽在超凈工作臺上先用70%酒精消毒30 s，接著用無菌水沖洗4～5次，再用0.1% HgCl2分別滅菌4、6、8、10、12 min，用無菌水沖洗5～6次，消毒過程中輕微地搖晃滅菌容器。處理完成后接種在不添加任何激素的WPM培養(yǎng)基上。每個處理接種20瓶，每瓶接種1個外植體，共重復3次，接種15 d后統(tǒng)計外植體污染率和萌發(fā)率。

1.2.2 激素組合對休眠芽萌發(fā)的影響 以WPM為基本培養(yǎng)基，同時添加濃度為0.8、1.0、1.2、1.5、1.8、2.0 mg·L-1的6-BA和0.1、0.2 mg·L-1的NAA及0.01、0.02 mg·L-1的IBA。接種滅菌后的休眠芽，每個處理接種10瓶，每瓶接種1個外植體，共重復3次，培養(yǎng)3～4周后統(tǒng)計外植體萌發(fā)情況。

1.2.3 激素組合對增殖的影響 初代培養(yǎng)得到的不定芽長到3～5 cm時，剪成長約1 cm的帶芽莖段進行增殖，增殖培養(yǎng)基為WPM基本培養(yǎng)基附加濃度為0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1的6-BA和0.01、0.02、0.05 mg·L-1的NAA，每個處理接種15瓶，每瓶接種2個外植體，共重復3次，培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計芽苗增殖系數(shù)、增殖苗健康指數(shù)。

1.2.4 基本培養(yǎng)基類型、IBA及蔗糖濃度對不定根誘導的影響 選取生長健壯、葉色濃綠、高約5 cm無根單苗進行生根培養(yǎng)。分別以WPM、MS、1/2 MS為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖20、25、30、35 g·L-1，附加濃度為0.4、0.5、0.8、1.0 mg·L-1的IBA。每個處理接種20瓶，每瓶接種1個外植體，共重復3次，接種后定期觀察、記錄生根時間，培養(yǎng)25 d時統(tǒng)計生根條數(shù)，計算生根率、生根指數(shù)、根健康指數(shù)。

1.2.5 煉苗移植 選用生根培養(yǎng)25 d后生長健壯、葉色鮮綠、根系發(fā)育良好的組培苗進行煉苗移植，先將組培苗取出培養(yǎng)室，讓其帶蓋適應溫室環(huán)境5 d，第6天開始逐漸開蓋，第8天完全開蓋后再存放5 d。后用清水沖洗干凈組培苗根系附著的培養(yǎng)基，移植于裝有混合基質（國產泥炭:國產水苔:腐殖質體積比為1:4:1）的營養(yǎng)缽中。移植后每天噴水4～6次，保持小環(huán)境濕度在90%以上，溫度控制在20～25℃，21 d后統(tǒng)計成活率及生長狀況。

1.2.6 培養(yǎng)條件與數(shù)據統(tǒng)計分析 若無特別說明，所有培養(yǎng)基均添加蔗糖30 g·L-1、瓊脂7 g·L-1，pH調至5.8，高溫（121℃）高壓滅菌20 min，培養(yǎng)溫度為（25 ± 2）℃，光周期16 h/8 h，光照強度36 μmol·m-2·s-1。

增殖系數(shù) = 增殖芽數(shù)/接種芽數(shù)

增殖苗健康指數(shù) = 增殖苗生長狀況值之和/增殖苗總數(shù)（增殖苗生長狀況劃分為“3”、“2”、“1”3個級別，其中，“3”表示芽苗生長健壯、莖干粗壯、葉片大且鮮綠；“2”表示生長較健壯、黃葉較少、無玻璃化；“1”表示生長一般、葉片小而卷曲、存在部分黃葉莖干稍細弱）。

根健康指數(shù) = 根系生長狀況值之和/生根苗總數(shù)（根系生長狀況劃分為“3”、“2”、“1” 3個級別，其中，“3”表示根粗細適中不易斷裂，長度適中，有大量須根；“2”表示根較粗壯易斷裂，有少量須根；“1”表示根較細弱，無須根）。

生根指數(shù) = 生根率 × 平均根長 × 平均生根數(shù)

使用SPSS軟件對所統(tǒng)計數(shù)據進行方差分析（ANOVA）和顯著性檢驗，顯著水平為P＜ 0.05。

2 結果與分析

2.1 0.1% HgCl2對無菌外植體獲得的影響

高污染率、褐化死亡率及低萌發(fā)率極大地限制了植物組織培養(yǎng)體系的建立。由表1可以看出：滅菌劑處理時間不同，外植體接種后生長狀態(tài)不同；隨著0.1% HgCl2處理時間的延長，外植體的污染率呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，但與此同時，由HgCl2自身引起的外植體褐化程度也逐漸加劇，當處理時間為8 min時，除去褐化及污染的影響，外植體萌發(fā)率達到所有處理中最高值，為60%。因此，綜合上述3個指標，篩選出最適宜紅樺外植體消毒滅菌的方法為：先用70%酒精消毒30 s，無菌水沖洗3～4次，然后用0.1% HgCl2消毒8 min，無菌水沖洗5～6次。

表1 0.1% HgCl2滅菌時間對無菌外植體獲得的影響Table 1 Effects of 0.1% HgCl2 sterilization time on the acquisition of sterile explants

2.2 激素組合對休眠芽萌發(fā)的影響

初代培養(yǎng)結果（表2）表明：不同激素組合對休眠芽的萌發(fā)以及生長狀態(tài)影響不同；當添加一定濃度的NAA時，隨著6-BA濃度的增加，外植體的萌發(fā)率總體呈先上升后下降的趨勢，當NAA濃度為0.1 mg·L-1、6-BA濃度為1.5 mg·L-1時，外植體萌發(fā)率達到最高，為83.33%，且此時外植體生長狀態(tài)最佳，休眠芽在培養(yǎng)1周左右時開始萌發(fā)，葉片全部展開后莖也逐漸開始伸長生長；而當6-BA濃度一定時，NAA濃度升高，外植體萌發(fā)率逐漸下降，外植體生長狀態(tài)無明顯變化，當NAA濃度為0.2 mg·L-1時，所有處理下的外植體均不產生莖，平均萌發(fā)率也較添加0.1 mg·L-1NAA時下降了10.61%。休眠芽初代培養(yǎng)過程中最主要的問題是只萌發(fā)展葉而不伸長生長，這樣狀態(tài)的外植體無法用于增殖以及生根培養(yǎng)。初代培養(yǎng)所有試驗中，只有B4和B5處理下，外植體產生了莖，但B5誘導產生的莖較細弱，且葉片出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，綜合考慮，紅樺休眠芽初代培養(yǎng)最佳激素配比組合為1.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA。

表2 植物生長調節(jié)劑對初代培養(yǎng)的影響Table 2 Effects of plant growth regulators on primary culture

2.3 激素組合對增殖的影響

將紅樺帶芽莖段接種到含有不同激素配比的增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)約7 d莖段基部開始分化出芽點，周圍產生綠色愈傷組織。培養(yǎng)40 d后的統(tǒng)計結果（表3）表明：增殖系數(shù)以及增殖苗健康指數(shù)均隨6-BA濃度的升高呈先上升后下降的趨勢，當6-BA濃度為1.5 mg·L-1時，增殖系數(shù)較1.0、2.0 mg·L-1濃度分別高出66.54%、62.37%，健康指數(shù)分別高出64.18%、46.67%，增殖情況最佳；隨著NAA濃度增加，增殖系數(shù)和健康指數(shù)的變化趨勢也表現(xiàn)為先上升后下降，在濃度為0.02 mg·L-1時，平均增殖系數(shù)為3.73，平均健康指數(shù)為1.75，均達到3個濃度處理中最高值。因此，紅樺增殖培養(yǎng)最佳植物生長調節(jié)劑配比為1.5 mg·L-16-BA+ 0.02 mg·L-1NAA，此處理下紅樺增殖系數(shù)達到4.77，健康指數(shù)達到2.45。

表3 植物生長調節(jié)劑對增殖培養(yǎng)的影響Table 3 Effects of plant growth regulators on the proliferation culture

2.4 基本培養(yǎng)基類型、IBA及蔗糖濃度對不定根誘導的影響

生根培養(yǎng)約7 d，外植體基部可見嫩根生出，生根培養(yǎng)過程中也伴隨著壯苗效果，組培苗的長勢逐漸變好，莖變粗，葉片變大且顏色由淡綠變?yōu)榇渚G。培養(yǎng)25 d不同基本培養(yǎng)基以及不同濃度IBA對生根的影響見圖1，3種不同基本培養(yǎng)基下的平均生根率（圖1A）高低次序依次為：1/2 MS ＞WPM ＞ MS，1/2 MS培養(yǎng)下的平均生根率為84.9%，為MS培養(yǎng)的2.6倍；雖然1/2 MS培養(yǎng)下紅樺生根率最高，但其平均生根條數(shù)（圖1B）、根長（圖1C）、生根指數(shù)（圖1D）均小于WPM培養(yǎng)下生根苗的相應指標，分析根健康指數(shù)（圖1E），WPM培養(yǎng)下根健康指數(shù)平均為1.77，高于另外2種基本培養(yǎng)基，生根苗也更易移植成活，因此，紅樺最佳生根基本培養(yǎng)基為WPM。

圖1 基本培養(yǎng)基類型及IBA濃度對紅樺不定根誘導的影響Fig.1 Effects of basic medium type and IBA concentration on the induction of adventitious roots of Betula albo-sinensis

不同濃度IBA處理的平均生根率高低次序為：0.8＞1.0＞0.5＞0.4 mg·L-1，分別為75.8%、74.2%、73.3%、14.67%，可看出IBA濃度與生根率先呈正相關，在0.8 mg·L-1時生根率達最高值，而當濃度升至1.0 mg·L-1時，生根率則有所下降。綜合考慮生根率及無根單株生根狀態(tài)，即生根數(shù)、根長、健康指數(shù)及生根指數(shù)，得出以WPM為基本培養(yǎng)基，附加0.8 mg·L-1IBA時生根效果最佳，此處理下生根率達到100%，健康指數(shù)也高達2.61。

蔗糖濃度對生根培養(yǎng)的影響見表4，生根率隨蔗糖濃度的升高而逐漸增加，當濃度超過25 g·L-1時，各處理間的差異并不顯著。在濃度為30、35 g·L-1時均達到了100%的生根率，但在30 g·L-1蔗糖的處理下，平均生根條數(shù)、根長、生根指數(shù)、健康指數(shù)均高于35 g·L-1的處理，表明紅樺生根培養(yǎng)添加最適蔗糖濃度應為30 g·L-1。

表4 蔗糖濃度對生根培養(yǎng)的影響Table 4 Effects of sucrose concentration on rooting culture

2.5 煉苗移植

組培瓶苗移植第2天開始原有葉片開始逐漸萎蔫掉落，第7天開始從側芽處萌發(fā)新葉，第14天左右結束緩苗，植株長勢逐漸恢復，葉片逐漸變大且顏色變翠綠，莖也變粗壯且逐漸木質化，21 d統(tǒng)計移植成活率為83.9%。

3 討論

無菌外植體的獲得是植物組織培養(yǎng)無菌體系建立的第一步，選擇合適的消毒滅菌方法對組織培養(yǎng)研究具有重要意義[11-12]。郭軍戰(zhàn)等[13]通過對四倍體刺槐的研究，發(fā)現(xiàn)用莖段作外植體時，用0.1%HgCl2滅菌10 min效果最好，而本研究用紅樺休眠芽做外植體，得出用0.1% HgCl2處理8 min時滅菌效果最佳，當滅菌時間為10 min時，外植體污染率無顯著變化而萌發(fā)率卻顯著降低。這可能是因為外植體類型及狀態(tài)有所不同，剝去芽鱗的休眠芽比莖段更脆弱，長時間接觸滅菌劑會造成外植體損傷而降低萌發(fā)率。不同外植體的適宜消毒滅菌方法不盡相同，滅菌劑的選擇需要根據外植體的大小與堅硬程度等決定，其成分及處理時間會對外植體產生不同的滅菌效果，滅菌時間過短會滅菌不徹底，導致外植體出現(xiàn)污染，而滅菌時間過長則會損傷外植體，引起外植體的褐化死亡現(xiàn)象。

增殖培養(yǎng)的效果好壞是大規(guī)模快繁體系建立的關鍵[14]，細胞分裂素與生長素的合理使用可促進芽苗增殖。他人研究發(fā)現(xiàn)，適宜白樺、垂枝樺、西南樺增殖培養(yǎng)的植物生長調節(jié)劑配比分別為1.0 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA、0.75 mg·L-16-BA+0.75 mg·L-1KT+0.1 mg·L-1NAA、0.5 mg·L-16-BA+0.01 mg·L-1NAA[15-17]。本研究得出最適宜紅樺增殖的激素配比為1.5 mg·L-16-BA+0.02 mg·L-1NAA。可見，樺木科樹種增殖培養(yǎng)所用激素多為6-BA與NAA，且前者常用濃度為0.5～1.5 mg·L-1，后者則為0.01～0.1 mg·L-1，垂枝樺的增殖培養(yǎng)雖然使用了6-BA和KT兩種細胞分裂素，但其總量仍未超過1.5 mg·L-1。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，隨著6-BA和NAA濃度的增加，增殖系數(shù)、增殖苗健康指數(shù)均呈先上升后下降的趨勢，兩類激素濃度過高或過低雖在一定程度上可使芽苗數(shù)量增加，但增殖系數(shù)與增殖苗健康指數(shù)均不佳，增殖苗不適用于生根培養(yǎng)。不同樺樹增殖苗質量隨著激素濃度變化呈現(xiàn)不同的變化趨勢，細胞分裂素與生長素的最佳比例需在具體研究過程中進行不斷試驗。

外植體是否生根決定了組培快繁體系建立的成敗[18]，影響生根培養(yǎng)的因素主要有基本培養(yǎng)基、激素濃度與配比、蔗糖、瓊脂等附加物的濃度、培養(yǎng)條件等[19]。一般用于生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基有1/8 MS、1/4 MS、1/2 MS、MS、WPM等，而生根率一般隨著培養(yǎng)基鹽濃度的降低而升高，但濃度過低則會無法滿足組培苗生根的營養(yǎng)需求[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，紅樺生根培養(yǎng)效果為WPM ＞ 1/2 MS ＞ MS。張麗杰等[22]通過對歐洲垂枝樺生根的研究也得出了相同的結論，雖然1/2 MS培養(yǎng)下紅樺生根率與WPM培養(yǎng)下無顯著性差異，但所生根質量不高，根粗壯、易斷裂、須根少，而WPM培養(yǎng)下所生根粗細適中不易斷裂，長度適中，有大量須根，更適宜于煉苗移植，這可能是因為WPM培養(yǎng)下組培苗基部形成的愈傷組織較少，使得所生根與維管束聯(lián)系更緊密，地上部分長勢更好，移植成活率高。除去基本培養(yǎng)基，生長素IBA在多種植物不定根的誘導起到較好的作用[23]。本研究表明，當添加IBA濃度小于1.0 mg·L-1時，其濃度與生根效果呈正相關，而當濃度達到1.0 mg·L-1時，生根率、生根指數(shù)、健康指數(shù)均有所下降，最適于生根培養(yǎng)的濃度為0.8 mg·L-1，這與黃永偉等[24]對文冠果生根因素研究結果相同，IBA雖然對不定根的產生有促進作用，但濃度過高則會起到抑制作用。

一切植物組織都不能在沒有碳水化合物的條件下生長，碳水化合物的作用是作為碳源和滲透壓穩(wěn)定劑，一般植物組織培養(yǎng)在以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中[25-26]。魏爽[27]研究結果表明，在蔗糖濃度為30 g·L-1時，遼東櫟的根長勢較好，而在濃度為20 g·L-1時，根系雖健壯，但苗的長勢弱，葉片發(fā)黃。本研究試驗了20、25、30、35 g·L-1蔗糖對紅樺不定根誘導的影響，結果也表明，當添加30 g·L-1蔗糖時，對生根培養(yǎng)起到有效的促進作用；而詹亞光等[28]對白樺的相關研究則表明，蔗糖濃度對白樺組培苗生根率影響不顯著。不同植物的生長特性導致其生長所需蔗糖量不同，通過上述研究結論對比可知，遼東櫟與紅樺生根過程對蔗糖的需求量相近，當蔗糖濃度過低時，植物無法獲得生長所需碳源而生長不良，過高則會導致培養(yǎng)基滲透壓過高影響外植體的正常生長；而白樺的研究結論則可能是因為其試驗是在添加了0.2 mg·L-1IBA的條件下進行的，IBA對生根的影響程度更大，蔗糖濃度在一個適宜的范圍內并不會對生根率造成明顯影響。

4 結論

通過對紅樺組織培養(yǎng)各個階段進行試驗，最終建立了完整的紅樺器官發(fā)生途徑再生體系，培養(yǎng)過程見圖2，即以紅樺休眠芽為外植體，先用70%酒精消毒30 s，無菌水沖洗3～4次，然后用0.1%HgCl2消毒8 min，無菌水沖洗5～6次獲得無菌材料，初代培養(yǎng)最適宜激素配比為WPM +1.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA；增殖培養(yǎng)最佳配比為WPM +1.5 mg·L-16-BA+0.02 mg·L-1NAA；生根培養(yǎng)最佳配比為WPM +0.8 mg·L-1IBA，所有培養(yǎng)基配比均附加30 g·L-1蔗糖與7 g·L-1瓊脂；生長良好組培苗移植于裝有混合基質（國產泥炭∶國產水苔∶腐殖質體積比為1∶4∶1）的營養(yǎng)缽中，21 d統(tǒng)計移植成活率為83.9%。此體系可為紅樺良種選育、定向培育、遺傳轉化等研究奠定重要基礎。