油茶耐低磷指標鑒定及芽苗砧篩選

曾 進，趙 蘭，劉 娟，段永康，王淑媛，王振麗，蓋甜甜，任志華，郭曉敏，胡冬南

(1. 江西農業大學林學院, 江西省森林培育重點實驗室, 江西 南昌 330045；2. 江西省林業科技推廣和宣傳教育中心, 江西 南昌 330045)

磷是植物生長所必需的元素之一，也是構成植物體內核酸、蛋白等大分子物質的重要組分，對植物發育起著重要作用[1-2]。土壤中的磷主要以無機磷形式被植物吸收[3]，由于鐵、鋁等金屬離子易與土壤顆粒形成難溶性物質，導致土壤中可以被植物吸收利用的有效磷含量極低，施入土壤的磷肥當季利用率不足25%[4-5]。施磷肥是解決植物缺磷的直接方法，但過量磷肥會造成土壤板結，污染水體[6]，我國磷肥大多依賴進口，價格高，且目前磷庫資源匱乏[7]，施磷肥并不是最佳解決途徑。研究發現，植物在遺傳過程中會形成不同的養分吸收策略[8]，同一植物不同品種間的營養吸收、利用效率也有很大差異[9]。因此，從植物本身出發，研究其在不同磷營養環境下生長及養分差異，篩選不同磷營養效率品種，是解決土壤有效磷缺乏，提高植物養分吸收利用效率的有效途徑。

油茶（Camellia oleiferaAbel.）是重要的木本油料樹種，生產上油茶良種通常采用嫁接繁殖[10]，砧木和穗條通過嫁接后成為一個共生體，砧木為植物提供養分和水分，砧木的營養狀況直接影響了嫁接苗的成活率和生長發育[11]。目前，砧穗互作研究主要集中在嫁接親和性上[12-14]，忽略了砧木本身營養吸收利用差異帶來的影響。油茶主要分布在我國南方，而南方林地土壤普遍有效磷含量低[15]，限制了油茶的生長。貧磷會減少油茶生物量、磷積累量[16-17]，還會影響油茶發芽和結實[18]。耐低磷油茶有較強的根系生長能力，通過發達的根系分泌更多的酸性磷酸酶與有機酸來提高有效磷的利用[19-20]，還會通過調節磷轉運蛋白來適應低磷環境[21-22]。油茶低磷適應性是從形態、生理多方面綜合表現的[16,18]，通過多指標綜合篩選出耐低磷及磷高效油茶才是解決油茶林地土壤有效磷缺乏的關鍵。不同油茶無性系及砧穗組合對低磷脅迫的響應有顯著差異[17,23]。油茶為異花授粉植物，同一母本不同子代間為半同胞家系。其他植物研究表明，不同基因型半同胞家系的磷利用效率存在較大差異[24]，但油茶不同基因型半同胞家系的磷利用效率差異還未知。因此，本試驗采用沙培法，研究江西省主推的12個品種油茶半同胞實生子代的耐低磷能力差異，篩選油茶耐低磷指標，并得到耐低磷油茶砧木。油茶耐低磷指標判別以及耐低磷芽苗砧篩選，對油茶良種選育與緩解磷肥消耗有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試油茶材料

試驗材料是江西省主推的12個品種油茶半同胞實生子代，主推品種詳細信息見表1。

表1 試驗材料Table 1 Experimental material

1.2 試驗設計

2018年收集12個品種油茶的成熟果實，脫殼取種籽，12月份播種沙藏，待長出子葉后移至口徑為20 cm、河沙為基質的圓底花盆中，每盆3株，每處理9盆，每盆底部放置托盤。所有油茶苗在江西農業大學科技園大棚內培養，根據基質濕度適當補充水分，每12 d左右澆灌1次營養液。霍格蘭營養液配方為：Ca(NO3)2·4H2O 4 mmol·L-1,KNO33 mmol·L-1, MgSO4·7H2O 2 mmol·L-1, H3BO350 μmol·L-1, ZnSO4·7H2O 15 μmol·L-1, CuSO4·5H2O 2 μmol·L-1, MnSO4·H2O 50 μmol·L-1, H2MoO414 μmol·L-1, Fe-Na2-EDTA 100 μmol·L-1，磷 源 由KH2PO4提供，不足的鉀用KCl補充。2019年3月開始澆灌霍格蘭營養液，培養8個月后測定各品種油茶幼苗在正常磷(1 mmol·L-1KH2PO4)和低磷(0 mmol·L-1KH2PO4)下的各項生長及養分指標，3個生物學重復。

1.3 測定指標與方法

每個處理選長勢較一致的油茶收獲整株，洗凈根系，將根、莖、葉分離。用Expression 10000XL 3.49掃描儀掃描整個根系，Win RHIZO(Pro2012b)分析并計算總的根系指標。CI-203手持式激光葉面積儀測定整株葉片形態。分離后的根、莖、葉放入烘箱中，100℃殺青30 min后65℃烘至恒質量，用電子秤分別稱量根、莖、葉干質量，并計算根冠比。H2SO4-H2O2消煮根、莖、葉后，Smart Chem 200全自動智能化學分析儀測定各組織全磷，并計算磷積累量、磷利用效率。公式如下：

總磷積累量 (mg) = 總干質量/全磷

總磷利用效率 (g·mg-1) = 總干質量/總磷積累量

1.4 數據統計與分析

用SPSS 25.0進行相關性、主成分、逐步回歸分析，結合隸屬函數綜合評價12個品種油茶半同胞實生子代的耐低磷順序，運用 Heml 1.0 Heat map Illustrator 軟件進行聚類熱圖分析。相關指標計算公式[25]如下:

1.4.1 各指標耐低磷系數

1.4.2 油茶綜合指標隸屬函數值

式（2）中：μ(Xj)表示第j個綜合指標的隸屬函數值，Xj表示第j個綜合指標值；Xmax表示第j個綜合指標的最大值，Xmin表示第j個綜合指標的最小值。

各綜合指標權重：

式中：Wj表示第j個綜合指標在所有綜合指標中的重要程度及權重;Pj為各品種第j個綜合指標的貢獻率。

1.4.3 油茶的耐低磷能力

式中：D表示在低磷脅迫條件下油茶耐低磷能力的綜合評價值。

2 結果與分析

2.1 各指標耐低磷系數差異分析

由于不同品種油茶半同胞實生子代在低磷和正常磷下生長差異較大，為消除種間誤差，用耐低磷系數能更準確的反映其耐低磷能力大小[26]。表2表明：低磷下各油茶的地上干質量、總根長、總根表面積、葉面積、葉長、葉寬以及總磷積累量與正常磷(P1)相比均有所下降(耐低磷系數 ＜ 1)，其中，CL18的地上干質量和葉面積耐低磷系數最接近1。除CL3和CL18外，其他油茶的根冠比耐低磷系數均大于1，除W1外的所有油茶總磷利用效率的耐低磷系數也都大于1，但是不同油茶的各指標變化幅度不同。因此，用單項指標的耐低磷系數來評判油茶的耐低磷能力大小，結果會有很大差異。

表2 油茶各指標的耐低磷系數Table 2 Low-P tolerant coefficient of C.oleifera

2.2 各指標相關性分析

由表3可以看出：許多性狀指標間存在著較強關聯性，如地上干質量與總根長、總根表面積、總根體積、葉面積、總磷積累量呈顯著(P＜ 0.05)或極顯著(P＜ 0.01)正相關，總磷積累量與根干質量、地上干質量呈極顯著正相關(P＜ 0.01)，根全磷、地上全磷、植株全磷均與總磷利用效率呈極顯著負相關(P＜ 0.01)。

表3 油茶各指標耐低磷系數的相關性Table 3 Correlation of low-P tolerant of each character of C.oleifera

2.3 主成分分析

根據表4可知：主成分分析將14個與耐低磷相關的指標轉化為4個主成分，其特征根均大于1，其中，主成分1的貢獻率為26.546%，主成分2的貢獻率為22.948%，主成分3的貢獻率為21.353%，主成分4的貢獻率為19.550%。這4個主成分可作為評價油茶耐低磷的綜合指標。

特征向量表明了各個性狀對主成分負荷影響的程度和方向。表4表明：第1主成分中，總根長、總根表面積和總根體積有較大的正系數值，說明這3個指標對第1主成分有較大的正面影響，這3個指標反映了根系生長，因此，將第1主成分歸為根系形態指標。第2主成分中，植株全磷、地上全磷有較大正系數值，植株總磷利用效率有較大負系數值，說明第2主成分大時，植株全磷、地上全磷會增大，而植株總磷利用效率會降低；第2主成分主要反映了植株的磷營養積累能力，第2主成分歸為磷營養指標。第3主成分中，根干質量的系數值最大，第3主成分歸為根生物量指標。第4主成分中，葉面積、葉寬、葉長有較大的正向系數，第4主成分歸為葉形態指標。

表4 各綜合指標系數及貢獻率Table 4 Coefficients of each comprehensive index and contributive ratio

2.4 綜合評價

2.4.1 隸屬函數分析 根據公式(2)計算12個品種油茶半同胞實生子代4個綜合指標CI(j)的隸屬函數值μ(Xj)，由表5可知：83-4隸屬函數值最大(μ(X1)=1)，CL53隸屬函數值最小(μ(X1)=0)，表明83-4在CI(1)綜合指標中耐低磷能力最強，而CL53耐低磷性最差。

2.4.2 權重計算 利用公式(3)計算其權重Wj，得到4個綜合指標的權重分別為0.294、0.254、0.236、0.216(表5)。

表5 油茶的綜合性狀指標值、權重、μ(Xj)及綜合評價值（D）Table 5 The value of comprehensive index, weight, μ(Xj), and comprehensive valuation (D) in C.oleifera

2.4.3 綜合指標評價值(D）計算及品種聚類 利用公式(4)計算油茶耐低磷綜合評價值(D)，根據D值大小得到不同品種油茶的耐低磷能力順序為：CL18 ＞ CL40 ＞ G8 ＞ CL4 ＞ W2 ＞ 83-4 ＞ GX48 ＞W1 ＞ CL53 ＞ CL3 ＞ GF20 ＞ 84-3。

采用最大距離法對D值進行聚類分析(圖1)，可以將12個品種油茶半同胞實生子代耐低磷能力分為3類，第Ⅰ類：GF20、CL3、84-3，為相對不耐低磷敏感類型；第Ⅱ類：W1、CL53、GX48,為中間型；第Ⅲ類：G8、CL4、W2、CL40、CL18、83-4，為相對耐低磷類型。

圖1 油茶耐低磷性聚類圖Fig.1 The cluster of low-P tolerance in C.oleifera

2.5 建立回歸模型和篩選鑒定指標

為了解各項測定指標與D值間的相關程度，篩選出關鍵的油茶耐低磷鑒定指標，以綜合評價值D為因變量，各項測定指標為自變量，做逐步回歸分析，建立回歸模型為：D= -0.960 + 0.666PA+0.341SPC+ 0.379TRA+ 0.460LW+ 0.197RPC,（方程決定系數R2= 0.997，P＜ 0.01）。根據方程結果，14個指標篩選出PA（總磷積累量）、SPC（地上全磷）、TRA（總根表面積）、LW（葉寬）、RPC（根全磷）這5個相關性更強的指標。對回歸方程的精度比較(表6)發現：精度均在95%以上，證明這5個指標對油茶耐低磷性影響顯著，此方程可用來評價其他油茶耐低磷性。

表6 回歸方程的估計精度分析Table 6 Analysis of estimated accuracy of regression equation

3 討論

油茶新造林面積在逐年增加，大多數高產油茶已采取集約式經營，但是產量仍然不高，特別是單位面積的產量。調查發現，同一林分，相同管理措施下，同一品種不同株之間的產量差別很大，果實產量從1 kg到20 kg不等。油茶優良無性系主要通過芽苗砧嫁接的形式推廣和應用，實際生產中通常以實生苗胚根作為砧木，在嫁接繁育時一般只注重選用良種穗條，對砧木的選擇往往是隨機的，大量研究表明，抗逆性強的砧木能提高嫁接植株的抗逆能力，且砧木相對穗條來說對植株的影響程度更大[21,27]。磷缺乏是限制油茶高產的主要因素之一，在礦質元素中，磷是對光合作用及碳水化合物在地上部分與根系之間分配起重要作用的元素[8]。本研究結果表明，不同品種油茶半同胞實生子代芽苗砧對磷的吸收和利用效率有很大差異，砧木耐低磷性差異可能是單株產量差異大的原因之一。楊邵研究表明，長林18號種子和砧木形態表現優，發芽率高，百粒質量大，種間發芽率和百粒質量變異小，但以長林18號為砧木嫁接長林23號、長林40號、長林18號穗條的油茶成活率低，親和性較差[14]。本研究發現，長林18號實生后代的耐低磷能力較強，但嫁接后成活率如何以及是否還能保持較強的耐低磷能力和優良性狀，還值得進一步研究。

本研究發現，相對正常磷，低磷環境下大部分油茶實生子代的根冠比增大。植物缺磷時，受缺磷信號誘導，同化產物向根系轉運量增加，由于缺磷使代謝紊亂，從而使可溶性碳水化合物合成及運輸受阻，導致根系生物量增加同時減少地上生物量的積累，但是絕對生長量是低于正常磷的[28-30]。根冠比增加被認為是植物適應低磷脅迫的反應標志[31]。相關性分析結果表明，根冠比與根干質量顯著正相關，與地上干質量負相關但不顯著，根系干物質的大量積累或許是造成根冠比增加的主要因素。12種油茶半同胞實生子代的地上干質量、葉面積、葉長、葉寬以及總磷積累量均受到低磷的抑制作用，可能是由于低磷脅迫抑制了植物的磷吸收，胞內磷濃度降低，導致光合磷酸化水平下降，葉肉細胞減少，因此，葉片生長受阻[32-33]。缺磷還會抑制油茶幼苗側根分化和生長[34]，低磷下12種油茶芽苗砧的總根長、總根表面積均減少了。

相關性結果表明，地上干質量與總根長、總根表面積、總根體積顯著或極顯著正相關，植物地上與地下生長存在異速相關性，對養分的吸收也會互相影響[35]。總磷利用率與植株全磷、地上全磷、根全磷極顯著負相關。有研究表明，隨著磷濃度的降低，油茶磷積累量會減少，而磷利用效率增加[17]。植物在調控耐低磷脅迫時有磷轉運蛋白、轉錄因子等很多基因參與其中，是一個極為復雜的過程，與植物吸收和利用磷的相關指標有很多，用單個指標無法準確評判耐低磷性[36]。相關性分析發現，指標間存在顯著關聯性，說明指標間存在重疊信息，需要綜合評價。用綜合評價值評判磷效率類型的方法已在多個植物上應用[37-38]，因此，本研究以綜合指標值聚類分析12個品種油茶半同胞子代實生苗的耐低磷性。

4 結論

低磷脅迫下12個品種油茶半同胞子代實生苗生長受到抑制，根冠比和總磷利用效率增大是油茶適應低磷的普遍反應。GF20、CL3、84-3為相對不耐低磷類型；W1、CL53、GX48為相對中間型；G8、CL4、W2、CL40、CL18、83-4為相對耐低磷類型。以綜合評價值為自變量逐步回歸方程，鑒別出總磷積累量、地上全磷、總根表面積、葉寬、根全磷這5個指標可用來判斷油茶的耐低磷性。