接種平滑白蛋巢菌對蒿柳根系分泌物代謝組的影響

馬曉東，李 霞,2，鄒竣竹，白媛媛，孫振元，韓 蕾＊

(1. 中國林業科學研究院林業研究所國家林業局林木培育重點實驗室，北京 100091；2. 菏澤學院農業與生物工程學院（牡丹學院），山東，菏澤 274000)

多環芳烴（PAHs）是一類具有致癌、致畸、致突變效應的有機污染物，可在水體、土壤或沉積物中積累，被植物吸收而進入食物鏈中，通過生物富集作用對人類健康產生極大威脅[1-2]。在PAHs污染的諸多修復方法中，生物修復具有綠色環保、成本低、大面積應用等優點[3-4]，是目前最具潛力的方法之一。一般來說，PAHs的環數越高，其化學結構越穩定、疏水性越高，單一利用植物或白腐真菌對PAHs去除能力有限[5-7]。近來的研究表明，植物-白腐真菌聯合修復是一種高效的PAHs污染土壤的生物修復方法，能有效去除高分子量PAHs[8]。但目前植物-白腐真菌聯合修復策略的作用機理尚不完全清楚。

雖然植物從土壤中吸收和積累PAHs的能力有限，但植物能促進根際土壤環境中PAHs的降解，學者推測可能是植物和根際微生物相互協作的結果[9]。據報道，植物約20%的光合產物用于根部合成有機分子，并以根系分泌物的形式釋放到土壤中[10]。根系分泌物主要成分有低分子量有機酸（LWMOAs）、氨基酸、糖、酰胺、脂族酸、芳香酸、醇、酮和烯烴等，這些代謝物為植物根際土壤微生物提供碳源和氮源，包括PAHs降解菌，增加微生物的生物量和活性[11-13]，從而提高PAHs的降解率。此外，LWMOAs、氨基酸、糖類均在PAHs脫附方面有顯著效果，從而提高了PAHs的溶解度和生物可利用度，加速土壤中PAHs的降解[14-16]。研究表明[17]，低分子量PAHs處理下玉米的光合作用增強，玉米根系分泌物組分及其含量也趨于增加。目前尚不清楚接種平滑白蛋巢菌對蒿柳根系分泌物的影響，后者是影響根際PAHs降解菌生長的重要因素。

近來，在環境學科中使用的非靶向代謝組學引起了生物學者們的廣泛關注，代謝組技術的進步使研究人員能夠在短時間內分析一個樣品中的數百種化合物。植物產生的代謝物范圍比其他任何一類生物體都要廣，代謝組學在植物科學中的重要性也相應更高[18]。利用非靶向代謝組學進行植物組織內代謝產物的研究日漸增多，但針對植物根系分泌物的代謝組學研究相對較少[13,19-22]。根際代謝組學的關鍵在于如何收集原生狀態的根系分泌物。大多研究利用霍格蘭營養液、石英砂等基質對植物進行培養并收集根系分泌物，這些方法的好處在于有效消除土壤環境的噪音干擾，但生長介質能影響根系形態、分泌的方式和代謝物組分[23]。同時，由于考慮到污染土壤修復實際情況，以及需要滿足白腐真菌的定殖、生長和產酶條件時，需選擇土壤作為培養基質。

基于此，本研究在溫室中設置了為期60天的盆栽試驗，選擇蒿柳（Salix viminalisL.）和平滑白蛋巢菌（Crucibulum laeve）作為試驗材料，試驗材料的選擇以及該組合體系的研究價值在先前研究[24]中有詳細表述，利用自然衰減（NA），真菌修復（M），植物修復（P）和植物-微生物聯合修復（PMR）等4種策略修復PAHs污染土壤，利用非靶向代謝組學定性和定量分析蒿柳的根際土壤代謝物，從根系分泌物的角度研究了PAHs污染土壤中蒿柳對平滑白蛋巢菌刺激的應答機理，以期為植物-白腐真菌聯合修復的作用機理研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 污染土壤、植物與真菌接種物

試驗土壤取自北京郊區的農場(40°10′59″ N；116°27′21″ E)，取樣深度為場地0～20 cm內。該農場常年種植蔬菜和谷物，土壤是中國北方常見的黃褐色土。土壤運送至實驗室后拌勻并室溫下陰干，過2 mm網篩。土壤性質按國標測定，測得pH：8.7，CEC：23.1 cmol·kg-1，有機質：20.1 g·kg-1，總氮：972.0 mg·kg-1，菲：36.6 μg·kg-1，芘：17.4 μg·kg-1，苯并[a]芘：28.5 μg·kg-1，總PAHs：280.3 μg·kg-1。土壤中加入高純度的菲、芘、苯并[a]芘（溶于丙酮，10%土壤質量）混合液并置于通風柜中，待丙酮完全蒸發后，將污染土壤和無污染土壤均勻混合，使土壤中菲、芘、苯并[a]芘的初始含量分別為約4 000 μg·kg-1、4 000 μg·kg-1、2 000 μg·kg-1，隨后將污染土裝入塑料箱中置于室溫下老化6周，并再次過2 mm網篩。

植物修復材料為蒿柳，選取種植于中國林科院苗圃的蒿柳無性系一年生枝條，按直徑1.0 ± 0.3 cm的規格，在水中剪成長度為12 cm的插條，隨后將插條插入清水中吸足水分，再扦插于φ8 cm × 10 cm的營養缽中，栽培基質為草炭土∶珍珠巖=6∶1（v/v），定時澆水。發芽后在溫室中繼續培養4周，選擇長勢均勻良好的蒿柳扦插苗用于試驗。

平滑白蛋巢菌（Crucibulum laeve）從中國普通微生物菌種保藏管理中心獲取，將其接種到麥芽提取物培養基上，24℃下靜置培養2周獲取新鮮的接種物。隨后，按照Reina等人[25]描述的方法進行固態發酵并做修改：選大麥種子作為纖維素基質載體，在1 000 mL錐形瓶中加72 g大麥種子和120 mL無菌水高壓滅菌，然后將4個真菌瓊脂板在80 mL無菌水(55% v/w)中混勻，取40 mL真菌接種物接種到大麥培養基，在24℃下靜置培養4周。接種前將所有真菌接種物置入塑料桶中并混勻。

1.2 有機污染試劑

本試驗中用到的甲醇、乙腈、乙酸銨與氨水購自德國CNW Technologies公司（ANPEL Laboratory Technologies（Shanghai）Inc.），均為LC-MS級別試劑。所用到的水是雙重去離子后的超純水，超純水儀純化系統為Millipore產品（Millipore, Bedford,MA）。內標：L-2-氯苯丙氨酸（2-Chloro-Lphenylalanine，純度 ≥ 98%），購自上海恒柏生物科技有限公司。菲、芘、苯并[a]芘純品（純度高于分析級）為本試驗的模式PAHs化合物。

1.3 試驗設計

PAHs污染土壤修復試驗在中國林業科學研究院科研溫室中進行，溫室溫度20～28℃，16/8 h的光/暗周期。取若干相同規格的聚丙烯盆，總容積為5 L，每盆中單獨堆放約5 kg受污染的土壤，4種處理分別為：a. 自然衰減（土壤不額外引入其他生物）（NA）；b. 真菌強化（將大麥種子混入土壤中并移栽蒿柳，接種微量（0.05 g·pot-1）含有大麥培養基的平滑白蛋巢菌接種物）（M）；c. 植物修復（土壤中種植蒿柳）（P）；d. 植物-微生物聯合修復（將大麥種子混入土壤中并移栽蒿柳，接種微量（0.05 g·pot-1）含有大麥培養基的平滑白蛋巢菌接種物（PMR）。應用于污染土壤的大麥種子：土壤質量比為0.6∶10。土壤水分保持在60%的田間持水量，需要定期稱量，并添加蒸餾水，試驗每周隨機改變聚丙烯盆位置一次。在試驗第60天進行土壤取樣：取P和PMR處理蒿柳的根際土壤，取樣方法是用手大力搖動蒿柳根部，在保持根部完整性的同時除去未附著在根部的外部土壤，留取附著在根部的土壤進行非靶向代謝組學分析；對NA和M處理的土壤樣本也進行非靶向代謝組學分析，目的是剔除土壤環境噪音對根系分泌物分析的干擾，取樣方法是用螺旋狀取土鉆從各處理的土壤剖面中抽取5個小樣本，將小樣本混合后過2 mm網篩。各處理均取6個重復，樣品保存在-80℃用于代謝物的提取和檢測。

1.4 代謝物的提取與檢測

取超低溫冷凍保存的土壤樣本，對樣本進行真空冷凍干燥。樣本冷凍干燥后稱取 100 mg樣品，加入 1 000 μL提取液（甲醇∶乙腈∶水 = 2∶2∶1（v/v），含同位素標記內標混合物）后渦旋混勻30 s，在35 Hz條件下研磨4 min，冰水浴中超聲提取5 min，在-40℃下靜置 1 h。隨后將樣品在4℃下12 000 r·min-1離心15 min，取上清于進樣瓶中用于液相色譜-質譜聯用（LC-MS）分析。同時，所有樣品另取等量上清混合成QC樣品上機檢測。在分析過程中，每6～10個檢測分析樣本中插入一個質控樣本，以監測試驗的重復性。

樣品的檢測使用了Vanquish (Thermo Fisher Scientific)超高效液相色譜儀，方法參照Wang,et al.[26]的描述。通過Waters ACQUITY UPLC BEH Amide (2.1 mm × 100 mm, 1.7 μm)液相色譜柱對目標化合物進行色譜分離。液相色譜A相為水相，含25 mmol·L-1乙酸銨和25 mmol·L-1氨水，B相為乙腈。梯度洗脫：0～0.5 min，95% B; 0.5～7 min，95%～65% B；7～8 min, 65%～40% B；8～9 min，40% B；9～9.1 min，40%～95% B；9.1～12 min，95% B。流動相流速：0.5 mL·min-1，柱溫：25℃，樣品盤溫度：4℃，進樣體積3 μL。

Thermo Q Exactive HFX質譜儀能夠在控制軟件（Xcalibur，Thermo）控制下進行一級、二級質譜數據采集。詳細參數如下：鞘氣流速：50 Arb，輔助氣流速：10 Arb，毛細管溫度：320℃，一級分辨率：60 000，二級分辨率：7 500，碰撞能：10/30/60 NCE 模式，噴射電壓：3.5 kV (正離子)或-3.2 kV (負離子)。在進行LC-MS/MS檢測時，同時結合使用了正離子模式（POS）和負離子模式（NEG）兩種電離方式，這樣可使代謝物覆蓋率更高，檢測效果更好。

1.5 代謝物的定性與定量

原始數據經ProteoWizard軟件轉成mzXML格式后，使用R包XCMS (3.2版本)進行峰識別、峰提取、峰對齊和積分等處理。然后對數據進行過濾，在一組樣本（QC樣本也是作為一組樣品）中檢測出該物質的樣本數 ≥ 50%，就保留該物質（minifrac = 0.5）。對數據進行內標歸一（即每個樣本中，其它物質的峰面積除以（內標的峰面積/所有樣品內標峰面積均值）[27]。與BiotreeDB（V2.1）自建二級質譜數據庫匹配進行物質注釋，對代謝物進行定性，算法打分的Cutoff值設為0.3。

1.6 數據分析

利用主成分分析（PCA）反映各處理間總體代謝物的差異以及組內樣本間的變異度大小，對樣品的代謝表型進行聚類。結合多元統計分析OPLSDA的變量投影重要性（VIP）和單變量統計分析t檢驗、p值來篩選各組樣本間的顯著差異代謝物[28]。顯著差異的閾值設置為：VIP ≥ 1 且 t檢驗的p＜ 0.05。

2 結果與分析

2.1 LC-MS分析

試驗第60天時，通過POS模式檢測并鑒定了各處理樣品中881種化合物，通過NEG模式檢測并鑒定了各處理樣品中828種化合物。將所有代謝物進行數據min-max標準化后進行聚類分析并繪制熱圖（圖1），可直觀展示各處理樣品的代謝物組成和含量有明顯差別。已鑒定的化合物包括丙酸、琥珀酸、苯甲酸、戊酸、庚酸、癸酸、山楂酸等有機酸，半胱氨酸等氨基酸，松二糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖等糖類，15-棕櫚酸甲酯、5-羥基水楊酸酯等酯類；此外還有醇、酮、腺苷、酰胺、生物堿、醛等小分子代謝物。

2.2 蒿柳潛在根系分泌物組分的模式識別分析

采用主成分分析法（PCA）和正交偏最小二乘判別分析法（OPLS-DA），將已鑒定的代謝物進行聚類，以區分各處理間代謝物的變化，并鑒定潛在的根系分泌物組分。本研究利用PCA對P處理、NA處理樣品的代謝表型進行了聚類，在PCA評分圖（圖2）中，每個數據點代表一個樣品，聚集在一起的點具有比分開的點更相似的生化組成。圖2A顯示POS模式下P處理和NA處理間的樣品能顯著區分，表明蒿柳顯著影響了根際土壤代謝物的組分和含量。隨后應用OPLS-DA最大化各處理樣品間差異，如圖2所示，在POS模式和NEG模式下P處理和NA處理的樣品均有明顯的分離。應用OPLS-DA生成的載荷圖和VIP評分（表1）來解釋代謝模式，在POS和NEG模式下總共篩選到18種化合物并將其假定為根系分泌物組分，包括丙二酸、乙醛酸、鄰苯二甲酸、4-甲基-2-氧戊酸、癸酸、十五烷酸、十六烷二酸、蓖麻油酸、棕櫚油酸、反式亞油酸等有機酸，半胱氨酸等氨基酸，葡萄糖、海藻糖、松二糖等糖類，5-羥基水楊酸酯等酯類，此外還有脯氨酸甜菜堿、L-抗壞血酸2-磷酸鈉、5′-甲硫腺苷等小分子代謝物。

表1 NA和P處理條件下土壤樣品間差異顯著的潛在根系分泌物組分Table 1 Potential root exudate components of soil samples between NA and P treatment (n = 6)

圖2 蒿柳根際土壤代謝物的多元分析。POS模式下的（A）PCA評分圖，（C）OPLS-DA評分圖；NEG模式下的（B）PCA評分圖，（D）OPLS-DA評分圖Fig.2 Multivariate analysis of rhizosphere soil metabolites from S. viminalis. (A) PCA scores plots and (C) OPLS-DA scores plots of OPLS-DA under POS mode; (B) PCA scores plots and (D) OPLS-DA scores plots of OPLS-DA under NEG mode

2.3 各處理對土壤代謝物組分和含量的影響

采用PCA對NA、M、P、PMR處理樣品的代謝表型進行分類，圖3顯示POS模式和NEG模式下各處理間的樣品均能明顯區分，表明各處理對土壤代謝物組分和含量均有不同影響。隨后，采用OPLS-DA對各處理間樣品兩兩比較生成的載荷圖，結合VIP評分篩選差異代謝物。由圖4可知，在POS模式下M處理、P處理相較于NA處理相對含量上調和下調的差異代謝物數量相當（相差 ＜ 15），但在NEG模式下相對含量上調的代謝物數量遠大于（相差 ＞ 150）下調的代謝物數量；兩種模式下，M處理相較于P處理樣品相對含量上調的代謝物數量大于（相差 ≥ 50）下調的代謝物數量；兩種模式下，PMR處理相比其它處理樣品相對含量下調的代謝物數量都大于（相差32-186）上調的代謝物數量。

圖3 各處理土壤樣品代謝物的PCA評分圖。（A）POS模式；（B）NEG模式Fig.3 PCA scores plots of soil metabolites among NA, M, P, and PMR treatments. (A) POS mode; (B) NEG mode

圖4 各處理組間兩兩比較的差異代謝物統計Fig.4 Differential expression metabolites statistics for the pairwise comparison between treatments

2.4 各處理對18種潛在根系分泌物組分的影響

各處理對18種潛在根系分泌物組分的影響如圖5所示。相比NA處理，M處理提高了十六烷二酸、半胱氨酸、5-羥基水楊酸酯、葡萄糖、4-甲基-2-氧戊酸、5′-甲硫腺苷、反式亞油酸、鄰苯二甲酸、十五烷酸、棕櫚油酸、癸酸、乙醛酸、蓖麻油酸、海藻糖、松二糖、L-抗壞血酸2-磷酸鈉等16種代謝物的相對含量；PMR處理提高了十六烷二酸、半胱氨酸、5-羥基水楊酸酯、葡萄糖、4-甲基-2-氧戊酸、5′-甲硫腺苷、反式亞油酸、鄰苯二甲酸、十五烷酸、棕櫚油酸、癸酸等11種代謝物的相對含量，而其它代謝物的相對含量下降或變化不明顯。PMR處理相較于P處理僅提高了葡萄糖和十五烷酸等2種代謝物的相對含量，相較于M處理提高了十六烷二酸、半胱氨酸、5-羥基水楊酸酯、葡萄糖、十五烷酸、棕櫚油酸、癸酸和丙二酸等8種代謝物的相對含量。

圖5 18種根系分泌物組分的箱線圖Fig.5 Box and whisker plot of 18 compounds from root exudates.

3 討論

根際代謝組學旨在分析根土交互界面的全部代謝物，包括了植物根系分泌的諸如初生代謝物、化學信號分子等植物天然產物，以及根際土著微生物、外源微生物分泌的代謝產物[23]。本研究利用非靶向代謝組學對各處理的土壤樣品進行了檢測，在POS模式下鑒定了881種化合物，NEG模式下鑒定了828種化合物，但有許多色譜峰未被鑒定。在此基礎上，本研究采用PCA和OPLS-DA兩種方法對P處理蒿柳根際土壤樣品和NA處理土壤樣品的代謝物組成和含量進行了比較，結果顯示蒿柳根際土壤的代謝譜發生明顯變化，并鑒定了18種差異代謝物作為潛在根系分泌物組分。

與其它類似研究一致的是，本研究篩選的18種根系分泌物組分大多為有機酸[13,17]。其中，丙二酸、乙醛酸、鄰苯二甲酸、4-甲基-2-氧戊酸等LMWOAs對釋放固著在有機質上的PAHs有積極影響，從而提高PAHs的生物利用度；它們還為微生物提供額外的營養源或改善土壤化學環境，從而提高PAHs降解微生物的數量和活性[29-30]。癸酸、十五烷酸、十六烷二酸、蓖麻油酸、棕櫚油酸、反式亞油酸等脂肪酸是疏水性化合物，它們可通過提高PAHs的溶解度進而提高植物、微生物對PAHs的可利用度[17]。與其它研究不同的是，本研究中測得的氨基酸數量較少，僅半胱氨酸一種。由于植物根系主要通過擴散等被動形式釋放氨基酸，推測該結果可能與速生植物的自身生長需要消耗大量氨基酸有關[31]。氨基酸，葡萄糖、海藻糖、松二糖等糖類同LMWOAs一樣，均為易分解化合物，可作為微生物群落的營養來源，對PAHs降解菌群生長有促進作用[17]。劉世亮等人[32]在研究苯并[a]芘的微生物共代謝修復時發現，向土壤中添加水楊酸、鄰苯二甲酸等化合物能縮短微生物馴化期和提高微生物酶活性，從而促進苯并[a]芘的共代謝降解。本研究雖未檢測到水楊酸，但檢測到了鄰苯二甲酸和5-羥基水楊酸酯，這印證了蒿柳根系分泌物可促進苯并[a]芘的生物降解的觀點。此外，在植物的乙烯合成過程中，5′-甲硫腺苷由S-腺苷甲硫氨酸（SAM）經酶催化作用合成，SAM參與了植物的逆境生理調節[33]；L-抗壞血酸2-磷酸鈉是一種性質穩定、水溶性的抗壞血酸，后者具有抗氧化能力[34]；脯氨酸甜菜堿作為可配伍溶質在鹽脅迫等逆境條件下可參與滲透勢調節的過程[35]，因而上述3種代謝物可能參與了蒿柳在PAHs污染逆境環境中的生理調節。

同樣，PCA對NA、M、P、PMR處理樣品的代謝表型進行分類的結果表明M、P和PMR處理對土壤代謝譜影響顯著。與P處理相同，M處理相較于NA處理也顯著提高了土壤代謝物的組分和含量，該結果的可能原因如下：首先，平滑白蛋巢菌或土著真菌具備分泌胞外酶的能力，如漆酶、錳過氧化物酶、木質素過氧化物酶等，可分解土壤環境中的木質素和PAHs等有機物，從而產生多種中間代謝產物[7]；其次，平滑白蛋巢菌和土著菌群間存在營養競爭或拮抗效應，能同時刺激雙方產生代謝物質介導微生物間的相互作用[30]。M處理相較于P處理含量上調代謝物明顯更多，表明平滑白蛋巢菌對土壤代謝組的影響大于蒿柳，因而其對土壤微生物的生物量、活性和群落結構的影響可能更大。PMR處理相比其它處理含量上調的代謝物明顯更少。上述結果表明，蒿柳受平滑白蛋巢菌影響加強了對多數土壤化合物的吸收，致使PMR處理樣品中代謝物的積累量普遍降低。這種促進作用能加速PAHs通過集流和擴散在植物體內積累的進程，因而與接種平滑白蛋巢菌能增強蒿柳的吸水動力和PAHs提取能力[24,36]的現象相吻合。此外，蒿柳-平滑白蛋巢菌聯合體系對土著微生物生長的刺激可能會加速土壤中代謝物的分解[37]，平滑白蛋巢菌對蒿柳生長的抑制效應也不容忽視[36]，上述因素均可能導致土壤中代謝物含量的減少。

18種根系分泌物組分中，M處理增加了其中16種組分的含量，這與土壤總代謝物情況相同，表明活性接種物或大麥種子中富含多種根系分泌物組分。PMR處理相較于NA增加了11種組分的含量，相較于M增加了8種組分的含量，該結果與土壤總代謝物情況不同，表明了蒿柳對根系分泌物的釋放和吸收過程同步發生。接種平滑白蛋巢菌促進根際土壤中葡萄糖和十五烷酸的積累，由于平滑白蛋巢菌對蒿柳生長有抑制作用，且M處理能提高葡萄糖和十五烷酸的含量，因而這種促進作用可能僅僅是M處理和P處理的加和效應。但PMR處理導致了絕大多數根系分泌物組分含量的減少，部分組分降到NA水平之下，表明平滑白蛋巢菌能促進蒿柳對多數根系分泌物組分的吸收，然而，這種促進作用弱化了植物的根際降解（植物與微生物協作降解PAHs）過程。從這個角度看來，接種平滑白蛋巢菌對植物修復的強化作用可能在于加強了植物提取過程，而非根際降解過程。

4 結論

本研究重點討論了PAHs污染土壤中接種平滑白蛋巢菌對蒿柳根際土壤代謝組的影響。首先，鑒定了18個潛在根系分泌物組分，討論了它們的功能和在PAHs污染修復中的潛在作用。接種平滑白蛋巢菌導致根際土壤代謝物組分和含量的明顯減少，其中有16種根系分泌物組分的含量明顯降低，推測這種現象可能是由于平滑白蛋巢菌促進了蒿柳根系對土壤代謝物的吸收，從而降低了根系分泌物在土壤中的積累。本研究中，接種白腐真菌促進了植物根系對多數土壤代謝物的吸收，進而加速了土壤PAHs通過集流和擴散作用在植物各組織中的積累，這對強化植物對土壤PAHs的修復效能有重要意義。綜上，本研究從根系分泌物的角度闡明了接種白腐真菌對蒿柳的生理影響，從而為揭示PAHs污染土壤植物-白腐真菌聯合修復的作用機理提供了新證據。