油桐尺蛾腸道菌群與桉樹葉片內生菌差異分析

鐘雅婷，鄒東霞，廖旺姣，黃 寧，羅 輯＊

(1. 廣西壯族自治區林業科學研究院，廣西 南寧 530002；2. 廣西林業有害生物天敵繁育工程技術研究中心，廣西 南寧 530002)

腸道為昆蟲的一個重要器官，由于腸道的特殊生態環境，其中棲息著大量的微生物。昆蟲腸道微生物與宿主昆蟲的生命活動密切相關，參與攝食、消化、排泄及繁殖等一系列過程，同時還與有毒物質的降解、信息素的合成以及宿主免疫反應等有關[1-3]。植食性昆蟲腸道微生物群落的結構與多樣性受到所食植物的影響。在對棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）[4]、菜粉蝶（Pieris rapae）[5]、小菜蛾（Plutella xylostella）[6]、松異舟蛾（Thaumetopoea pityocampa）[7]等昆蟲的研究中證實，腸道細菌群落的組成與昆蟲所食植物葉際細菌群落的組成相似，表明食物是植食性昆蟲腸道微生物的重要來源。植食性昆蟲啃食植物的同時會給植物造成大量傷口，這些傷口使植物更易受到病原微生物的侵入[8-9]。同時，腸道是病原微生物定殖的重要場所，部分病原微生物可在昆蟲腸道內存活，昆蟲則成為了病原微生物的越冬場所或來年病害的初侵染來源[10]。

油桐尺蛾（Buzura suppressaria）是為害桉樹的重要災害性食葉害蟲，近年來的為害率和為害面積均呈快速上升趨勢[11]。在以往的林間調查過程中，我們發現油桐尺蛾蟲害與葉部病害經常在同一片桉樹林中發生，但究竟是油桐尺蛾先為害然后引起病害侵入？還是病害先侵染桉樹，引起植株產生生理生化改變，繼而吸引油桐尺蛾為害？或者上述現象僅僅只是一個巧合？由于目前尚未有相關方面的報道，因此有必要對上述問題開展研究。目前對油桐尺蛾的研究主要集中在生物學、生理學、生態學、化學或生物防治等方面[12-14]。鑒于腸道微生物對油桐尺蛾的生命活動有重要影響，因此分析油桐尺蛾腸道微生物群落的結構和多樣性，尋找與桉樹葉部微生物的關聯，對于研究油桐尺蛾與桉樹間的互作機理、明確為害規律、尋找新的防治方法均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 油桐尺蛾幼蟲中腸組織的采集與處理

油桐尺蛾幼蟲采集自廣西國有東門林場桉樹林地。隨機選取20頭5齡油桐尺蛾幼蟲，饑餓24 h后于75%酒精中浸泡2 min，無菌水清洗3次并用濾紙擦干。實驗中所有解剖工具均經高壓滅菌，于超凈工作臺中解剖油桐尺蛾幼蟲，采集中腸組織。將中腸組織隨機分為5組，保存于-80℃冰箱備用。

1.2 桉樹葉樣品的采集與無菌化處理

在采集油桐尺蛾的同一片桉樹林地采集桉樹葉片。通過多點取樣的方式采集樣品，同組樣品等量混合成一個樣品（5 g·組-1）。葉片用無菌水洗滌30 s，浸泡于70%酒精中洗滌2 min，2.5% NaClO（含0.1% Tween 80）浸泡5 min，隨后將葉片轉移至70%酒精中浸泡30 s，用無菌水洗滌3次；葉片樣品經上述步驟處理后即可視為表面無菌，用于檢測葉片內生菌，保存于-80℃備用。

1.3 DNA提取

分別將油桐尺蛾中腸組織和經無菌化處理的桉樹葉樣品用液氮磨成粉末，采用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit試劑盒（OMEGA，M5635-02）提取樣品基因組DNA，具體操作參照試劑盒說明書。待基因組DNA抽提完成后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。每組樣品均設5個重復，油桐尺蛾中腸樣品編號為“BS”，桉樹葉樣品編號為“BCN”。

1.4 樣品細菌16s rDNA和真菌ITS rDNA擴增與純化

樣品細菌16s rDNA的擴增區域為16SV3-V4，采用細菌16s rDNA基因通用引物341F：5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′和805R：5′-GACT ACHVGGGTATCTAATCC-3′加接頭后進行PCR擴增。樣品真菌ITS rDNA擴增區域為ITS1-2，采用真菌ITS rDNA通用引物ITS1F：5′-CTTGGTCATT TAGAGGAAGTAA-3′和ITS2R：5′-GCTGCGTTC TTCATCGATGC-3′加接頭后進行PCR擴增。第一輪PCR反應體系（30 μL）：2 × Taq master Mix 15 μL，F/R引物（10 μmol·L-1）各1 μL，DNA10～20 ng，ddH2O補齊總體積至30 μL。第一輪PCR擴增條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，45℃ 20 s，65℃ 30 s，共5個循環；94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 30 s，共20個循環；72℃ 5 min。上述PCR反應結束后進行第二輪PCR擴增，引入Illumina橋式PCR兼容引物。第二輪PCR反應體系（30 μL）：2 × Taq master Mix 15 μL，F/R引物（10 μmol·L-1）各1 μL，上一輪PCR產物DNA 20 ng，ddH2O補齊總體積至30 μL。第二輪PCR擴增條件：95℃ 3 min；94℃ 20 s，55℃20 s，72℃ 30 s，共5個循環；72℃ 5 min。上述PCR反應結束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。使用磁珠純化方法對PCR產物進行純化，將純化產物保存于-80℃ 冰箱備用。

1.5 Illumina Miseq上機測序

利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒（Life，Q10212）對純化的PCR產物精確定量，以方便按照1∶1等量混合后測序。等量混合時，每個樣品DNA量取10 ng，最終上機測序濃度為20 pmol。樣品委托生工生物工程(上海)股份有限公司基于Illumina-Miseq技術測序平臺構建文庫，進行高通量雙末端測序。根據相似度，將序列聚類為操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），采用RDP（ribosomal database project）classifier貝葉斯算法對97%相似度水平的OTU代表序列進行分類學分析。使用RDP分類器對序列進行系統分析，并在各分類級別上對物種進行統計，依照OTU數據進行Alpha和Beta多樣性分析、物種分類樹分析、菌群差異分析。

2 結果

2.1 各組樣品OTU聚類及RDP分類

結果顯示（表1），5個BS樣品的細菌16s rDNA文庫測序共獲得3 271條有效序列，基于97%的序列相似性進行聚類分析，得到199個OTUs，共注釋到6門、11綱、19目、38科、43屬；真菌ITS rDNA文庫測序共獲得280 392條有效序列，得到4 279個OTUs，共注釋到8門、29綱、67目、159科、257屬。5個BCN樣品細菌16s rDNA文庫測序共獲得11 413條有效序列，得到379個OTUs，共注釋到10門、19綱、26目、54科、74屬；真菌ITS rDNA文庫為287 330條有效序列，獲得4 236個OTUs，共注釋到8門，31綱，79目，171科，291屬。從屬水平上看，BCN樣品的細菌和真菌數目均多于BS樣品。

表1 BCN和BS樣品OTU聚類及RDP分類水平統計Table 1 OTU clustering and RDP classification level statistics of BCN and BS samples

2.2 各組樣品細菌、真菌群落的α多樣性分析

細菌和真菌群落的α多樣性檢測結果顯示（表2），BCN和BS樣品物種覆蓋率均達97%以上，表明樣品所構建的細菌和真菌文庫均能有效反應其物種的多樣性，且各組樣品多樣性指數組內偏差較小，數據可靠。BCN樣品的細菌ACE指數和Chao l指數均明顯高于BS樣品，說明病害桉樹葉內生細菌的群落豐富度較高，而上述兩組樣品的真菌ACE指數和Chao l指數則無顯著差異，即兩者的真菌群落豐富度差異較小。此外，BCN細菌和真菌的Shannon指數、覆蓋率、Simpson指數較BS樣品均無統計學差異，表明兩組樣品在細菌、真菌群落多樣性、優勢菌種的集中程度方面無明顯差異。

表2 BCN和BS樣品α多樣性指數統計Table 2 Alpha diversity index statistics of BCN and BS samples

2.3 各組樣品細菌、真菌群落的主成分分析

采用PCA法對BCN和BS樣品的細菌和真菌群落進行主成分分析（圖1A、1B）。從總體上看，BCN與BS樣品大致分布在不同區域，表明BCN與BS樣品間細菌、真菌的組成和結構存在較大差異。其中，細菌群落分析結果中有1組重復、真菌群落分析結果中有2組重復與其各自所屬組別不在同一區域，可能是因為上述3組重復存在的偏差較大，從而導致PCA分析時出現誤差，但還需做進一步驗證。

圖1 BCN和BS樣品PCA分析Fig.1 PCA analysis of BCN and BS samples

2.4 各組樣品的細菌、真菌組成及多樣性分析

2.4.1 基于門和屬水平的各組樣品中細菌的種類組成 在門水平上（圖2A），BCN樣品和BS樣品的細菌均主要由變形菌門（Proteobacteria）組成，分別占（92.66%～99.65%）和（91.16%～97.56%），即變形菌門為兩組樣品的優勢菌門。

圖2 BCN和BS樣品細菌在門（A）和屬（B）水平的組成Fig.2 Composition of bacteria in BCN and BS samples at the level of phylum (A) and genus (B)

在屬水平上（圖2B），BCN樣品排名前五位的優勢菌屬分別為假單胞菌屬（Pseudomonas）（12.24%～59.14%）、不動桿菌屬（Acinetobacter）（6.37%～39.86%）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）（8.76%～39.11%）、拜葉林克氏菌屬（Beijerinckia）（0.85%～18.53%）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）（1.22%～12.09%）；BS樣品的優勢菌屬為假單胞菌屬（52.10%～86.97%）和甲基桿菌屬（4.42%～27.97%），而不動桿菌屬（0.41%～1.66%）、拜葉林克氏菌屬（0.2%～0.87%）和鞘氨醇單胞菌屬（0.2%～0.62%）的占比較少。

2.4.2 基于門和屬水平的各組樣品中真菌的種類組成 在真菌門分類水平上（圖3A），BCN和BS樣品的優勢菌門均為擔子菌門（Ascomycota），分別占78.68%～93.44%和64.42%～91.55%。

在屬水平上（圖3），BCN樣品中排名前三位的優勢菌屬分別為平臍疣孢屬（Zasmidium）（16.18%～60.82%）、假尾孢屬（Pseudocercospora）（5.53%～16.58%）、球腔菌屬（Mycosphaerella）（0.84%～10.47%），均為球腔菌科真菌；BS樣品中排名前三位的優勢菌屬分別為平臍疣孢屬（12.88%～40.68%）、假尾孢屬（10.63%～28.59%）和葉點霉屬（Phyllosticta）（4.06%～34.50%），球腔菌屬（2.45%～12.33%）則排名第四位。

圖3 BCN和BS樣品真菌在門（A）和屬（B）水平的組成Fig.3 Composition of BCN and BS samples at the phylum (A) and genus (B) levels

2.5 基于屬水平的各樣品細菌和真菌菌群豐度差異比較

BCN和BS樣品細菌菌群豐度的T-Test分析結果表明（圖4），BCN樣品中硝化桿菌屬（Nitrobacter）和苯基桿菌屬（Phenylobacterium）的豐度明顯低于BS樣品（P＜ 0.05），而Terriglobus菌屬和鞘脂菌屬（Sphingobium）的豐度顯著高于BS樣品（P＜ 0.05）。真菌菌群豐度的TTest分析結果顯示（圖5），BCN樣品中叉絲單囊殼屬（Podosphaera）、Pseudoteratosphaeria屬、Zymoseptoria屬的豐度均明顯高于BS樣品（P＜0.05）；而炭疽菌屬（Colletotrichum）、節擔菌屬（Wallemia）、曲 霉 菌 屬（Aspergillus）、Graphiola屬、黑孢屬（Nigrospora）、青霉菌屬（Penicillium）、梗孢酵母屬（Sterigmatomyces）的豐度均明顯低于BS樣品（P＜ 0.05）。

圖4 BCN和BS樣品中細菌菌群豐度差異T-Test比較（屬級水平）Fig.4 Comparison of the difference of bacterial flora abundance between BCN and BS samples by T-Test (genus level)

圖5 BCN和BS樣品中真菌菌群豐度差異T-Test比較（屬級水平）Fig.5 Comparison of fungal abundance difference between BCN and BS samples by T-Test (genus level)

2.6 桉樹病害病原菌所屬菌屬豐度差異比較

采用T-Test分析法分別對BCN和BS樣品中桉樹主要病害病原菌所屬菌屬的豐度進行比較。結果顯示（表3），BS樣品中引起桉樹炭疽病的炭疽菌屬豐度明顯高于BCN樣品（P＜ 0.05）。而BCN和BS樣品中引起青枯病的假單胞菌屬（Pseudomonas）、引起葉斑病類的葉點霉屬和假尾孢屬（Pseudocercospora）、引起花斑病的短梗霉屬（Aureobasidium）、引起紫斑病的殼針孢屬（Septoria）、引起枝枯病的毛色二孢屬（Lasiodiplodia）、引起梢枯病的新殼梭孢屬（Neofusicoccum）的菌群豐度則無顯著差異。

表3 BCN和BS樣品中桉樹病害病原菌菌群豐度差異T-Test比較（屬級水平）Table 3 Comparison of abundance difference of Eucalyptus disease pathogenic bacteria in BCN and BS samples by T-Test (genus level)

3 討論

本研究采用16s rDNA、ITS rDNA和Illumina Miseq技術分別對油桐尺蛾中腸和桉樹葉部內生的細菌、真菌群落組成和結構進行分析。其中，油桐尺蛾腸道細菌共注釋到6門、11綱、19目、38科、43屬，真菌共注釋到8門、29綱、67目、159科、257屬；桉樹葉部內生細菌共注釋到10門、19綱、26目、54科、74屬，真菌共注釋到8門，31綱，79目，171科，291屬。Alpha多樣性分析表明，桉樹葉部內生細菌的群落多樣性和豐富度均高于油桐尺蛾腸道細菌。在森林生態系統中，植物與環境中的多種因素均具有交互作用，如植物與土壤、植物與昆蟲、植物與植物之間等，這些復雜的交互作用形成了植物微生物的多樣性。與植物相比，昆蟲因活動區域的限制和腸道微環境條件的影響，體內的微生物種群相對單一。因此，盡管寄主植物是植食性昆蟲腸道微生物的主要來源[15]，但昆蟲腸道微生物群落的多樣性和豐富度均低于寄主植物。這一點在對BCN和BS樣品的PCA分析中也得到證實，兩組樣品在細菌和真菌的組成和結構上存在較大差異。上述結果表明，桉樹葉部微生物群落多樣化與油桐尺蛾腸道微生物群落的相對單一化均是對各自生存環境和功能適應的結果。

在桉樹葉部內生細菌和油桐尺蛾腸道細菌的組成中，變形菌門均占優勢地位。變形菌門細菌廣泛存在于自然界中，在土壤和動植物中均能檢測到[16-18]。變形菌門也廣泛存在于昆蟲體內，研究表明變形菌門在舞毒蛾（Lymantria dispar）[19]、家蠶（Bombyx mori）[20]、小菜蛾[21]、棉鈴蟲[22]等多種鱗翅目昆蟲幼蟲的腸道中均為優勢細菌。此外，變形菌門細菌的豐度在雙翅目的澤蘭實蠅（Procecidochares utilis）[23]、直翅目的沙漠蝗（Schistocerca gregaria）[24]、半翅目的點蜂緣椿象（Riptortus clavatus）[25]、鞘翅目的光肩星天牛（Anoplophora glabripennis）[26]等昆蟲的腸道中也位居前列。上述研究表明，變形菌門細菌在以自然植物為食的昆蟲中廣泛存在，通過昆蟲進食寄主植物進入至腸道并定殖，其豐度可能與昆蟲所食植物上攜帶菌群的多少有關。在細菌屬水平上，變形菌門中的假單孢菌屬、甲基桿菌屬均為BCN和BS樣品中的優勢細菌，其中又以假單胞菌的豐度最高。研究表明，假單胞菌能夠通過固氮作用為宿主提供營養物質[27]，在如克里角梢小蠹（Trypophloeus klimeschiEggers）等以缺乏氮營養的植物為食的昆蟲中，假單胞菌屬可通過固氮作用為蟲體提供更多的氮營養[28]。由此我們推測，油桐尺蛾腸道中高豐度的假單胞菌屬細菌可能來自于所食的桉樹葉片，假單胞菌屬細菌在腸道中發揮的功能可能與營養代謝有關。此外，本研究還發現桉樹葉部內生細菌和油桐尺蛾腸道細菌中的硝化桿菌屬、苯基桿菌屬、Terriglobus菌屬、鞘脂菌屬細菌的豐度存在顯著差異，但上述細菌在樣品中均占比較小，是否與寄主的生命活動相關也尚未明確，因此還需進一步探索研究。

擔子菌門是桉樹葉部和油桐尺蛾腸道的優勢真菌，前人在對克里角梢小蠹[29]和致倦庫蚊（Culex quinquefasciatus）[30]等的研究中也發現擔子菌門在腸道真菌中排名前列。擔子菌門是環境中的常見真菌，與部分昆蟲存在共生關系，如擔子菌門真菌中的Entomocorticium存在于松小蠹（Ips avulus）和食菌小蠹（Pityoborus comatus）的體表或體內，與上述小蠹蟲所食植物有關，并與寄主形成共生關系[31]。因此我們推測，油桐尺蛾腸道中高豐度的擔子菌門真菌可能來源自桉樹葉，且作為腸道優勢真菌可能在油桐尺蛾的生命活動中發揮重要作用。在屬水平上，本研究發現平臍疣孢屬、假尾孢屬、球腔菌屬均為桉樹葉部和油桐尺蛾腸道的優勢真菌。在非優勢真菌中，叉絲單囊殼屬、Pseudoteratosphaeria屬、Zymoseptoria屬、炭疽菌屬、節擔菌屬、曲霉菌屬、Graphiola屬、黑孢屬、青霉菌屬、梗孢酵母屬的豐度在兩種樣品中存在差異。

除此之外，我們發現在檢測的細菌和真菌群落中存在多個桉樹病害相關的病原菌屬。其中，假單胞菌屬是引起桉樹青枯病的茄青枯極毛桿菌（Pseudomonas solanacearum）的所屬菌屬[32]。青枯病可引起桉樹大面積枯萎壞死，是桉樹常見的細菌病害[33]。盡管假單胞菌屬為桉樹葉的優勢內生細菌，但并未在采集樣品的林地中發現桉樹感染青枯病的癥狀。同時，我們還在桉樹葉和油桐尺蛾腸道中檢測到了炭疽菌屬真菌的存在。炭疽菌屬的某些種類可以引起桉樹炭疽病[34]，本研究發現油桐尺蛾腸道中炭疽菌屬真菌的豐度顯著高于桉樹葉，可能在油桐尺蛾啃食桉樹葉的過程中或排出的糞便接觸健康葉片時導致該真菌侵染桉樹葉。葉點霉屬真菌在油桐尺蛾腸道中屬于優勢菌屬，而在桉樹葉內則豐度較低。葉點霉屬下的葉點霉菌（Phyllosticta lindericola）是引起桉樹葉斑病的病原之一[35]，但我們在林間調查時并未發現桉樹感染葉斑病的情況。此外，我們還在桉樹葉內和油桐尺蛾腸道中發現了其他可能引起桉樹病害的病原菌屬[36]，包括引起桉樹葉斑病的假尾孢菌（Pseudocercosporasp.）所屬的假尾孢屬，引起花斑病的出芽短梗霉菌（Aureobasidium pullulans）所屬的短梗霉屬，引起紫斑病的桉殼針孢菌（Septoria mortarlensis）所屬的殼針孢屬，引起枝枯病的可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）所屬的毛色二孢屬，引起梢枯病的新殼梭孢菌（Neofusicoccum parvum）所屬的新殼梭孢屬，這些菌屬在樣品中均非優勢菌屬，占比極小。盡管我們在采集的桉樹葉和油桐尺蛾腸道樣品中均檢測到了上述病原菌相關菌屬的存在，且其中的部分菌屬的豐度也較高，但在林間并未發現相關病害癥狀。推測可能這些病原菌的豐度并未達到造成病害的條件，或檢測到的菌屬中并不存在病害相關的病原菌。此外，一些細菌或真菌對上述病原菌具有拮抗作用，如惡臭假單孢桿菌（P.putida）、熒光假單孢桿菌（P. Fluorescens）和銅綠假單孢桿菌（P. aeruginosa）產生的抗生素能拮抗茄青枯極毛桿菌的生長[37]，這也可能是在林間并未發現相關病害的原因。但上述結論僅為推測，還需通過對樣品中相關細菌、真菌進行分離培養做進一步鑒定。

4 結論

本研究推測，生存環境和功能適應是導致桉樹葉部與油桐尺蛾腸道中細菌、真菌群落存在較大差異的原因。同時，油桐尺蛾腸道中的細菌和真菌的群落結構也受到所食桉樹葉的影響，而攜帶某些病原菌的油桐尺蛾啃食或其排泄物接觸可能是導致該病原菌侵染健康桉樹葉的原因。