miR-551b在潰瘍性結腸炎組織中的表達及意義

張镕宇 陳君婷 陳桂權 劉宇虎 黃妙興 陳曉春 李志堅

潰瘍性結腸炎(UC)是一種病因尚未完全明確的腸道炎性疾病，隨著人們生活方式及飲食習慣的改變，其發病率呈逐年升高趨勢[1-2]。UC臨床表現為便血、高熱及反復發作的腹痛等，且具有復發率高、并發癥多的特點[3-5]。隨著UC病情進展及反復發作，部分患者可出現腸道梗阻或穿孔等腸道結構性損傷，嚴重者甚至發生癌變[6]。因此，及時評估UC患者的預后情況并制定合理的治療方案，對于改善患者預后至關重要。UC疾病活動度可在一定程度上反映患者的預后情況，但判斷UC疾病活動度需采用腸鏡檢查。腸鏡檢查是一項侵入性操作，有部分人群因不能耐受或心理上難以接受而放棄檢查，且現有的內鏡評價方法易受主觀因素影響，如簡化內鏡評分及內鏡指數等[7]。細胞試驗表明，自噬相關蛋白LC3Ⅱ的異常表達可通過損傷腸道屏障功能誘發UC的發生、發展[2]。另有研究指出，miR-551b可通過激活NF-κB的活化調節LC3Ⅱ蛋白的表達，而LC3Ⅱ蛋白參與了UC的病理生理過程[8]。由此推測，miR-551b可能與UC的發生、發展有關。本文檢測了miR-551b在潰瘍性結腸炎(UC)組織中的表達水平，并探究其與患者預后的關系，以期為臨床評估UC患者的預后情況提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性選取2015年9月至2018年9月在東莞市人民醫院接受治療的75例UC患者作為研究對象。參照《中國炎癥性腸病診斷治療規范的共識意見》[9]診斷UC。納入標準：(1)符合UC診斷標準：(2)入組前未接受非甾體類抗炎藥、免疫抑制劑等藥物治療；(3)能夠配合完成隨訪；(4)簽署知情同意書。排除標準：(1)合并消化道惡性腫瘤；(2)合并全身感染性疾病；(3)合并嚴重的心、肝、腎、肺等臟器功能障礙；(4)妊娠期及哺乳期婦女。75例UC患者中男性45例，女性30例，年齡19～40歲，平均年齡為(26.99±4.03)歲；病變位于直腸32例，左半結腸22例，廣泛結腸21例。本研究獲得醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 miR-551b表達水平檢測

采用實時熒光定量PCR(real-time qPCR)法檢測UC患者miR-551b的相對表達量。無菌條件下剪碎黏膜組織，置于液氮中研磨，離心分離后取上層清液置于EP管中。應用TRIzol試劑盒提取總RNA，紫外分光光度計檢測RNA的純度及物質的量濃度。將2 μg的總RNA添加至20 μL反應液中，應用反轉錄試劑盒合成cDNA，然后PCR擴增。反應條件為：95 ℃ 10 min預變性，之后95 ℃ 42 s、15 s退火、70 ℃ 42 s，共計40個循環。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt表示miR-551b的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 UC疾病嚴重程度

按照《中國炎癥性腸病診斷治療規范的共識意見》[9]標準評估患者疾病嚴重程度。輕度 排便次數<4次/d，紅細胞沉降率<20 mm/h，血紅蛋白、體溫、脈搏正常；中度 排便次數4～6次/d，紅細胞沉降率20～30 mm/h，血紅蛋白41～119 g/L，體溫36.1～37.8 ℃，脈搏60～90次/min；重度 排便次數>6次/d，紅細胞沉降率>30 mm/h，血紅蛋白≤40 g/L，脈搏>90次/min，體溫>37.8℃。輕度、中度、重度劃分標準為同時滿足以上條件。

1.4 隨訪

采用復診方式對患者進行隨訪，觀察患者出院后12個月內的預后情況。本研究將復發、UC相關黏膜異常增生及癌變定義為預后不良。隨訪起始時間為2015年9月27日，截止時間為2019年10月4日，每3個月隨訪1次。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 UC患者的預后情況

75例UC患者在隨訪期間的預后不良發生率為42.67%(32/75)，其中復發23例(30.67%)，UC相關黏膜異常增生9例(12.00%)。

2.2 預后不良組和預后良好組的基本資料比較

預后不良組與預后良好組在年齡、性別、BMI、吸煙、飲酒、家族史、病變范圍、1年內應用免疫抑制劑、合并原發性硬化性膽管炎、IL-6、血紅蛋白、紅細胞沉降率、血小板計數方面比較，差異無統計學意義(P>0.05)；預后不良組重度活動度、初治時應用激素類藥物、肛周病變、基底漿細胞增多、腸切除術史的占比高于預后良好組，差異均有統計學意義(P均<0.05)。詳見表2。

2.3 兩組miR-551b相對表達量比較

預后不良組miR-551b的相對表達量為2.53±0.47，高于預后良好組(1.93±0.41)，差異有統計學意義(t=5.888，P<0.001)。

2.4 影響UC患者預后的因素

將疾病嚴重程度(輕、中度=0，重度=1)、初治時應用激素類藥物(否=0，是=1)、肛周病變(否=0，是=1)、基底漿細胞增多(否=0，是=1)、腸切除術史(無=0，有=1)、miR-551b作為自變量，α入=0.05，α出=0.10，將UC患者預后情況(預后良好=0，預后不良=1)作為因變量納入logistic回歸模型進行分析，結果顯示疾病嚴重程度、初治時應用激素類藥物、肛周病變、腸切除術史及miR-551b與UC患者的預后密切相關。詳見表3。

2.5 miR-551b、模型A、模型B評估UC患者預后的效能

采用多因素logistic回歸模型分析法構建由疾病嚴重程度、初治時應用激素類藥物、肛周病變、腸切除術史組成的預測UC患者預后的模型，公式：F=-0.666+1.163×疾病嚴重程度+0.064×初治時應用激素類藥物+1.360×肛周病變+0.095×腸切除術史，將其命名為模型A；構建由疾病嚴重程度、初治時應用激素類藥物、肛周病變、腸切除術史、miR-551b組成的預測UC患者預后的模型，公式：F=-7.536+0.085×疾病嚴重程度+0.038×初治時應用激素類藥物+0.662×肛周病變+1.027×腸切除術史+3.088×miR-551b，將其命名為模型B。miR-551b預測UC患者預后的ROC曲線下面積(AUC)與模型A比較，差異無統計學意義(Z=1.039，P=0.299)；模型B預測UC患者預后的ROC AUC大于模型A和miR-551b的AUC，差異均有統計學意義(Z=2.268，P=0.023；Z=3.105，P=0.002)。詳見表4、圖1。

表2 兩組的基本資料比較

表3 影響UC患者預后的多因素logistic回歸分析

表4 miR-551b、模型A、模型B評估UC患者預后的效能

圖1 miR-551b、模型A、模型B評估UC患者預后的ROC曲線

3 討論

miRNA是一種在進化上趨于保守的內源性非編碼RNA，已有研究表明多種miRNA可參與UC的病理生理過程[10-12]，如有報道指出，miR-551b在UC患者中異常表達[13]，然而目前關于miR-551b與UC患者預后關系的報道較少。

本研究結果顯示，預后不良組患者miR-551b的相對表達量高于預后良好組，提示miR-551b可能與UC患者的預后存在聯系。本文采用多因素logistic回歸方法分析影響UC患者預后的因素，結果顯示疾病嚴重程度、初治時應用激素類藥物、肛周病變、腸切除術史與UC患者的預后密切相關，與既往報道相符[14-15]；同時，本研究結果表明，miR-551b與UC患者的預后密切相關。

研究表明，miR-551可通過促進NF-κB的表達調節自噬相關蛋白LC3Ⅱ的表達水平[8]，而LC3Ⅱ的異常表達可參與UC的發生、發展過程[2]。LC3Ⅱ蛋白定位于自噬泡內膜，LC3前體激活后形成LC3Ⅰ，LC3Ⅰ暴露的甘氨酸殘基可與自噬泡內膜磷脂酰乙醇胺結合成為LC3Ⅱ[16]。LC3Ⅱ蛋白是維持細胞穩態的重要物質，其在腸道胞內菌的清除過程中發揮關鍵作用[17]。LC3Ⅱ缺陷將導致持續性胞內菌感染，引起Paneth細胞形態學異常和分泌功能改變，誘發持續性腸道炎性反應[18]。此外，有細胞試驗表明，TNF-α與自噬抑制劑可協同作用于腸道上皮細胞，抑制LC3Ⅱ蛋白表達，使細胞黏附能力下降，損傷腸道上皮屏障功能，導致UC發生[19]。由此推測，miR-551b可通過調節LC3Ⅱ的表達參與UC的疾病進展。

本研究構建了miR-551b、模型A及模型B評估UC患者預后的ROC曲線，結果顯示模型B評估UC患者預后的效能高于miR-551b及模型A，提示聯合miR-551b更有利于評估UC患者的預后情況。

綜上所述，miR-551b與UC患者的預后關系密切，檢測miR-551b的表達水平有助于評估UC患者的預后情況。本課題組下一步將動態監測miR-551b的表達水平，并進行基礎研究，進一步分析miR-551b影響UC患者預后的病理生理學機制。