肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中TMEM16A的表達(dá)水平及意義

李龍輝 王 宇 高文廣 趙艷紅 高 明

肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血(EGVB)的病情兇險(xiǎn)，常危及患者生命[1]。研究表明，首次出血的患者在6周內(nèi)的死亡率為15%～20%，經(jīng)治療6周后仍有約20%患者再出血，嚴(yán)重影響患者預(yù)后[2]。若能預(yù)判EGVB或再出血情況，可有效改善患者預(yù)后。然而，目前尚缺乏有效預(yù)判EGVB患者再出血的指標(biāo)。

跨膜蛋白16A(TMEM16A)是一種鈣激活氯通道蛋白，可參與機(jī)體的多種病理生理活動(dòng)，如惡性腫瘤、腺體分泌及高血壓等[3]。研究顯示，TMEM16A可誘導(dǎo)高血壓大鼠模型血管內(nèi)皮功能障礙，從而升高血壓[4]。另有研究顯示，TMEM16A可調(diào)節(jié)門靜脈高壓大鼠模型門靜脈平滑肌細(xì)胞增殖[5]。基于此，推測TMEM16A可能通過調(diào)節(jié)門靜脈平滑肌細(xì)胞，參與了EGVB及再出血過程。目前關(guān)于TMEM16A與EGVB患者再出血的報(bào)道較少，本文對(duì)此展開研究，以期為EGVB的預(yù)防及治療提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年2月至2019年12月在廊坊市第四人民醫(yī)院就診的206例EGVB患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)B超或CT等影像學(xué)檢查確診為肝硬化；(2)經(jīng)胃鏡檢查確診為食管胃底靜脈曲張；(3)出現(xiàn)黑便或嘔血等癥狀；(4)簽署了知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)非肝硬化導(dǎo)致的消化道出血；(2)合并尿毒癥及血液系統(tǒng)疾病等；(3)合并惡性腫瘤；(4)門脈高壓性胃腸病；(5)先天膽道阻塞性擴(kuò)張；(6)不能配合完成研究所需檢查或隨訪失聯(lián)。206例EGVB患者中男性109例，女性97例，年齡24～76歲，平均年齡為(56.82±9.78)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 基本信息收集

收集患者的年齡、性別、肝硬化類型、Child-Pugh分級(jí)、白蛋白、凝血酶原時(shí)間、國際標(biāo)準(zhǔn)化比值、MELD評(píng)分、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、血鈉及治療方式等信息。采用電話隨訪及復(fù)診等方式了解入選患者24個(gè)月內(nèi)有無再出血發(fā)生及預(yù)后生存狀況，每3個(gè)月隨訪1次，以2020年4月3日或該時(shí)間點(diǎn)前患者死亡作為隨訪終點(diǎn)。本研究將發(fā)生再出血及死亡定義為預(yù)后不良[1]。

1.3 單個(gè)核細(xì)胞中TMEM16A表達(dá)水平檢測

采用密度梯度離心法獲取外周血中單個(gè)核細(xì)胞[6]。抽取EGVB患者入院24 h內(nèi)空腹外周靜脈血10 mL，置于Ficoll分離液中，提取單個(gè)核細(xì)胞。采用蛋白質(zhì)印跡法檢測單個(gè)核細(xì)胞中TMEM16A的表達(dá)水平[7]。將RIPA裂解液滴至盛有單個(gè)核細(xì)胞的試管中提取總蛋白，然后滴加勻漿緩沖液，4 ℃環(huán)境下以3 500 r/min離心15 min，取離心后上清液。10% SDS-PAGE分離膠電泳(120 V，100 min)，轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡，轉(zhuǎn)膜(300 mA，60 min)，然后使用5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h。滴加一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；滴加二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，曝光顯影。應(yīng)用ImageJ軟件進(jìn)行光密度分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 預(yù)后良好組與預(yù)后不良組的基本資料比較

206例EGVB患者中97例(47.09%)預(yù)后不良，其中72例(34.95%)再出血，25例(12.14%)死亡。根據(jù)患者的預(yù)后情況將其分為預(yù)后良好組(n=109)和預(yù)后不良組(n=97)。兩組在年齡、性別、肝硬化類型、凝血酶原時(shí)間、國際標(biāo)準(zhǔn)化比值和治療方式方面比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。預(yù)后良好組Child-Pugh分級(jí)B級(jí)占比，以及白蛋白、血紅蛋白和血鈉水平高于預(yù)后不良組，MELD評(píng)分和白細(xì)胞計(jì)數(shù)低于預(yù)后不良組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組基本資料比較

2.2 兩組TMEM16A表達(dá)水平比較

預(yù)后良好組TMEM16A表達(dá)水平為0.62±0.06，高于預(yù)后不良組(0.54±0.04)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.518，P<0.001)，見圖1。

圖1 預(yù)后良好組和預(yù)后不良組的TMEM16A表達(dá)

2.3 影響EGVB患者預(yù)后的因素

將EGVB患者預(yù)后作為因變量，將Child-Pugh分級(jí)、白蛋白、MELD評(píng)分、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、血鈉和TMEM16A作為自變量納入logistic回歸模型，結(jié)果顯示Child-Pugh分級(jí)、MELD評(píng)分和白細(xì)胞計(jì)數(shù)是EGVB患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，白蛋白、血鈉和TMEM16A是獨(dú)立保護(hù)因素(P<0.05)，見表2。

2.4 TMEM16A與EGVB患者預(yù)后的關(guān)系

采用限制性立方樣條擬合logistic回歸分析TMEM16A與EGVB患者預(yù)后的關(guān)系。通過比較不同節(jié)點(diǎn)個(gè)數(shù)所對(duì)應(yīng)的AIC值，最終確定節(jié)點(diǎn)個(gè)數(shù)為5時(shí)AIC值最小(AIC=176.356)。分析結(jié)果表明TMEM16A與EGVB患者預(yù)后有關(guān)(χ2=46.50，P<0.001)，且呈非線性關(guān)系(非線性檢驗(yàn)χ2=12.67，P=0.005)。TMEM16A診斷EGVB患者預(yù)后的最佳截?cái)嘀禐?.57，與TMEM16A=0.57比較，當(dāng)TMEM16A<0.57時(shí)，預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)較高；當(dāng)TMEM16A>0.57時(shí)，預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)較低，見圖2。

表2 影響EGVB患者預(yù)后的logistic回歸分析

圖2 TMEM16A與EGVB患者預(yù)后的限制性立方樣條圖

3 討論

EGVB是肝硬化失代償期的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，發(fā)病率和病死率均較高，預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)較高[8-10]。EGVB主要病因是肝硬化誘發(fā)的門靜脈壓升高[11]。既往研究表明，血管內(nèi)皮功能紊亂和平滑肌細(xì)胞異常增殖與高血壓關(guān)系密切[12-13]。Ma等[4]研究表明TMEM16A可通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能降低大鼠血壓。Zeng 等[5]研究指出，TMEM16A在膽管結(jié)扎誘導(dǎo)的門靜脈高壓大鼠模型中表達(dá)下調(diào)，且其表達(dá)下調(diào)會(huì)促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖。由此推測，TMEM16A可通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能及血管平滑肌細(xì)胞增殖參與EGVB的發(fā)生過程，檢測其水平或可評(píng)估患者預(yù)后。本研究通過比較兩組外周血單個(gè)核細(xì)胞中TMEM16A的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)預(yù)后良好組TMEM16A的表達(dá)水平高于預(yù)后不良組。

既往研究表明，EGVB患者的預(yù)后不良發(fā)生率約為40%[14-15]，本研究中EGVB患者的預(yù)后不良發(fā)生率(47.09%)與既往研究結(jié)果相近。張莉等[2]研究表明，Child-Pugh分級(jí)、MELD評(píng)分和白細(xì)胞計(jì)數(shù)是EGVB短期預(yù)后的危險(xiǎn)因素，而白蛋白、血鈉是EGVB短期預(yù)后的保護(hù)因素。本研究通過多因素logistic回歸分析影響EGVB患者預(yù)后的因素，結(jié)果顯示Child-Pugh分級(jí)、MELD評(píng)分和白細(xì)胞計(jì)數(shù)是EGVB患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而白蛋白、血鈉是EGVB患者預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素，與上述研究結(jié)果一致。此外，本研究結(jié)果還顯示，TMEM16A是EGVB患者預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素。本研究采用限制性立方樣條分析TMEM16A與EGVB患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與TMEM16A=0.57比較，當(dāng)TMEM16A<0.57時(shí)，預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)較高；當(dāng)TMEM16A>0.57時(shí)，預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)較低。提示低TMEM16A水平可反映血管平滑肌細(xì)胞異常增殖及血管內(nèi)皮功能紊亂，致使門靜脈壓升高，最終導(dǎo)致食管胃底靜脈曲張破裂出血。

本研究存在一些不足之處，如單中心研究、樣本例數(shù)偏少、隨訪時(shí)間較短等，且僅分析了TMEM16A與EGVB短期內(nèi)再出血的關(guān)系，下一步將針對(duì)以上不足開展多中心、大樣本研究，并延長隨訪時(shí)間，以驗(yàn)證本研究的結(jié)論。綜上所述，EGVB患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中TMEM16A的表達(dá)水平低提示其預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)較高，檢測其水平有助于評(píng)估患者預(yù)后。