長鏈非編碼RNA FENDRR在急性胰腺炎患者血清中的表達及意義

關幸求 吳慧華 江丹玲 鄒 兵

急性胰腺炎(AP)以胰腺局部炎性反應為主要特征，可伴有多器官功能衰竭，嚴重危害人們的健康[1]。AP的病理機制十分復雜，目前尚未被完全闡明。AP根據疾病嚴重程度，可分為輕癥AP(MAP)和重癥AP(SAP)，其中SAP患者的病死率為17%～30%[2-3]。目前，SAP尚無特效的治療方案，僅能依靠重癥監護維持患者生命。因此，及時了解AP患者的病情嚴重程度及預后情況，對于選擇合適的治療方案具有重要意義?，F階段，臨床醫生多參考急性生理與慢性健康狀況評分Ⅱ(APACHEⅡ)、RANSON評分評估AP患者病情，但因兩種評分計算較為復雜，且耗時較長[4]，臨床急需一種簡便、快捷的指標評估AP患者的病情及預后。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一種長度超過200個核苷酸，且不參與編碼蛋白質的RNA分子，在細胞增殖、分化及多種疾病的發生、發展中發揮重要作用[5-6]。lncRNA叉頭蛋白F1相鄰非編碼發育調控RNA(FENDRR)位于chr3q13.31，長度為3 099個核苷酸，由4個外顯子組成[7]。有報道指出，lncRNA FENDRR可參與小鼠的心臟發育[8]。近年來有研究表明，lncRNA FENDRR與骨肉瘤、乳腺癌、胃癌等發病有關[9-11]。目前關于lncRNA FENDRR與AP的關系尚不十分清楚。研究表明，lncRNA FENDRR在AP大鼠模型中表達下調[12]。此外，另有研究顯示，lncRNA FENDRR可調控AP細胞模型中AR42J細胞的凋亡[13]。AP細胞的凋亡與AP患者的病情及預后密切相關，本文探究了lncRNA FENDRR在AP患者血清中的表達水平及臨床意義，以期為評估AP的病情及預后提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年3月至2018年5月在北京大學深圳醫院就診的123例AP患者作為研究對象，設為AP組。123例AP患者均根據《中國急性胰腺炎診治指南(2013，上海)》[14]進行診斷。納入標準：(1)患者伴有AP典型的臨床特征，如急性突發的持續上腹部疼痛，并伴肩部疼痛；(2)患者血淀粉酶高于正常值上限3倍及以上；(3)CT/MRI圖像提示患者腹部呈AP樣變化。排除標準：(1)合并其他慢性疾病，且處于急性發作期；(2)合并腫瘤；(3)放棄治療或轉院未取得后續聯系的患者；(4)未簽署知情同意書。AP組患者中男性68例，女性55例，年齡28～69歲，平均年齡為(49.61±7.61)歲，其中MAP患者71例(APACHEⅡ評分<8分)、SAP患者52例(APACHEⅡ評分≥8分)；結石性AP有52例，酒精性AP有21例，高脂血癥性AP有37例，其他病因導致的AP有13例。另擇同期在本院體檢的52位健康志愿者作為對照組，其中男性25例，女性27例，年齡29～66歲，平均年齡為(49.01±8.74)歲。兩組受試者在年齡、性別方面比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 信息收集 收集受試者的性別、年齡、病因等信息。收集AP患者入院24 h內生物化學指標水平。使用CD-3700血細胞分析儀(美國雅培公司)檢測白細胞(WBC)、紅細胞分布寬度(RDW)、血小板(PLT)水平，使用7600型全自動生化分析儀(日本日立公司)檢測AP患者C反應蛋白(CRP)、乳酸、乳酸脫氫酶(LDH)、總膽紅素(TBil)、血清鈣、血清淀粉酶水平，使用C3100全自動血凝儀(邁瑞公司)檢測國際標準化比值(INR)。計算AP患者入院24 h內的APACHEⅡ評分。通過住院觀察、復診及電話隨訪等方式了解AP患者入院后28 d的預后生存狀況。

1.2.2 lncRNA FENDRR表達水平檢測 于AP患者入院24 h內抽取肘部靜脈血10 mL，3 500 r/min離心15 min。提取上層清液至無菌凍存管中，低溫環境中保存，待測。采用實時熒光定量PCR(real-time qPCR)法檢測血清lncRNA FENDRR的相對表達量。具體步驟如下：(1)按1∶3的比例將TRIzol試劑加入提取的血清中提取血清總RNA，并使用分光光度計測定RNA的純度和物質的量濃度，若A260/A280范圍在1.75～1.95，進行后續操作；(2)取總RNA 2 μg，通過反轉錄試劑盒及儀器合成cDNA；(3)PCR擴增，反應條件：95 ℃ 10 min預變性，然后95 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s、72 ℃ 45 s，共40個循環。以GAPDH作為內參，采用2-△△Ct表示lncRNA FENDRR的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 AP組和對照組血清lncRNA FENDRR表達水平的比較

AP組患者血清lncRNA FENDRR的相對表達量為4.47±1.87，低于對照組(6.66±1.26)，差異有統計學意義(t=8.999，P<0.001)。

2.2 lncRNA FENDRR評價AP患者病情嚴重程度的價值

SAP組和MAP組在年齡、性別和病因方面比較，差異均無統計學意義(P均>0.05)，具有可比性(見表2)。SAP組患者血清lncRNA FENDRR的相對表達量為3.14±1.22，低于MAP組(5.45±1.64)，差異有統計學意義(t=8.607，P<0.001)。血清lncRNA FENDRR診斷AP患者病情嚴重程度的ROC曲線下面積(AUC)為0.869(95%CI：0.796～0.923)，最大約登指數為0.623，其所對應的最佳截斷值、敏感度、特異度分別為0.378、71.15%和90.14%。見圖1。

表2 MAP組和SAP組的基本資料比較

圖1 血清lncRNA FENDRR診斷AP患者病情嚴重程度的ROC曲線

2.3 影響AP患者預后的因素分析

123例AP患者中有25例(20.33%)在隨訪期間死亡。將年齡、性別、病因、WBC、RDW、PLT、CRP、TBil、INR、血清鈣、血清淀粉酶、乳酸、LDH和lncRNA FENDRR等可能影響AP患者預后的因素納入單因素分析，結果顯示RDW、PLT、CRP、INR、血清鈣、乳酸和lncRNA FENDRR可能與AP患者的預后有關(見表3)。按α≤0.1，將RDW(≥15.49%為1，<15.49%為0)、PLT(≥174.16×109/L為1，<174.16×109/L為0)、CRP(≥7.12 mg/dL為1，<7.12 mg/dL為0)、INR(≥2.09為1，<2.09為0)、血清鈣(≥8.81 mg/dL為1，<8.81 mg/dL為0)、乳酸(≥2.55 mg/dL為1，<2.55 mg/dL為0)和lncRNA FENDRR(≥4.47為1，<4.47為0)作為自變量，將AP患者預后(死亡為1，生存為0)作為因變量，納入二元logistic回歸分析，結果顯示PLT、INR、血清鈣、乳酸和lncRNA FENDRR是影響AP患者預后的獨立危險因素(見表4)。

表3 影響AP患者預后的單因素分析

表4 影響AP患者預后的二元logistic分析

2.4 PLT、INR、血清鈣、乳酸和lncRNA FENDRR評估AP患者預后的效能

單指標評估AP患者預后的結果指出，PLT的評估效能最大，lncRNA FENDRR次之，乳酸的評估效能最小。構建PLT、INR、血清鈣、乳酸和lncRNA FENDRR聯合檢測評估AP患者預后的模型，公式：F=16.669-0.976×lncRNA FENDRR-0.023×PLT-1.678×INR-1.242×血清鈣+1.053×乳酸。聯合檢測的效能高于PLT、INR、血清鈣、乳酸和lncRNA FENDRR單獨檢測的效能(Z=4.067，P<0.001；Z=4.940，P<0.001；Z=4.599，P<0.001；Z=4.357，P<0.001；Z=3.872，P<0.001)。見圖2、表5。

圖2 PLT、INR、血清鈣、乳酸和lncRNA FENDRR評估AP患者預后的ROC曲線

表5 PLT、INR、血清鈣、乳酸和lncRNA FENDRR評估AP患者預后的效能

3 討論

AP是一種常見的急腹癥，嚴重者可導致患者死亡[15]。伴隨AP病程進展，患者可發生全身炎癥反應綜合征、多器官功能衰竭及代謝性酸中毒、休克等，往往預后較差[16]。及時評估AP患者病情，有助于完善治療方案，從而改善患者的預后情況[17]。

本研究結果發現，AP組患者血清lncRNA FENDRR的表達量低于對照組，SAP組患者血清lncRNA FENDRR的相對表達量低于MAP組，提示lncRNA FENDRR與AP的發生、發展密切相關。本研究構建了lncRNA FENDRR診斷AP患者病情嚴重程度的ROC曲線，結果顯示AUC為0.869，敏感度為71.15%，特異度為90.14%，提示lncRNA FENDRR在評價AP患者病情嚴重程度方面具有一定價值。此外，為進一步探究lncRNA FENDRR與AP患者預后的關系，本文采用單因素和多因素logistic回歸分析影響AP患者預后生存的相關因素，結果顯示PLT、INR、血清鈣、乳酸和lncRNA FENDRR與AP患者的預后關系密切。PLT、INR是反映凝血的重要指標。當AP發病時，機體釋放大量炎性介質，引發全身炎癥反應綜合征，促進PLT激活[18]。屆時，因機體微循環發生障礙，導致參與循環的PLT水平降低，INR也隨之降低[19]。目前AP的發病機制尚未完全闡明，有研究表明低鈣血癥與AP患者的病情嚴重程度有關，推測低鈣血癥可能通過調節甲狀旁腺激素參與AP病情進展[20]。本研究結果顯示，當乳酸>2.55 mg/dL時，AP患者預后生存狀況較差，這與Valverde-López等[21]的研究結果相似。此外，本文結果還顯示，當lncRNA FENDRR≥4.47時，AP患者的預后情況較好，推測lncRNA FENDRR可能通過調控AP細胞凋亡影響AP患者的預后。

本研究構建了PLT、INR、血清鈣、乳酸、lncRNA FENDRR及聯合檢測評估AP患者預后的ROC曲線，結果發現PLT的評估效能最大，其次為lncRNA FENDRR，乳酸的評估效能最小。PLT、INR、血清鈣、乳酸和lncRNA FENDRR聯合檢測評估AP患者預后的效能高于PLT、INR、血清鈣、乳酸和lncRNA FENDRR單獨檢測的效能。上述結果表明，聯合檢測可彌補lncRNA FENDRR單獨評估AP患者預后情況的不足。

綜上所述，血清lncRNA FENDRR的表達水平可反映AP患者的病情嚴重程度及預后情況。lncRNA FENDRR可能是AP病情嚴重程度和預后評估的潛在生物標志物。本研究存在樣本例數偏少、單中心研究等不足。今后將進行多中心、大樣本研究，并動態觀察AP患者血清lncRNA FENDRR的表達水平，以期為準確評估AP的病情嚴重程度及預后情況提供幫助。