散結抑癌方聯合貝伐珠單抗對BALB/c裸鼠結腸癌肺轉移的影響

張瑩瑄 任建琳 吳杏黎 陸鑫熠 黃人可

結直腸癌是全球范圍內病死率占第2位、發病率占第3位的惡性腫瘤[1]。據2018年的全球腫瘤數據統計顯示，2018年結直腸癌新增病例180萬，占全球惡性腫瘤新增人數的6.1%，死亡人數超過88萬(占5.8%)[2]。目前臨床治療晚期結直腸癌的常用方法包括手術治療、放射治療、靶向治療聯合化學治療。一項有關結直腸癌患者生存率的預測分析報道指出，約35%的患者在Ⅱ、Ⅲ期診斷時表現為轉移性結直腸癌，而高達50%患者在診斷時表現為非轉移性結直腸癌，最終卻表現為轉移性結直腸癌，提示復發轉移仍然是人類治療結直腸癌需要攻克的主要難題[3]。中西醫結合治療晚期結直腸癌可在一定程度上延長患者無進展生存期，提高客觀緩解率[4-5]。散結抑癌方為任建琳醫師治療晚期結直腸癌的經驗方，在原有健脾復方基礎上進一步優化而來，前期研究已證實健脾復方可抑制結直腸癌細胞增殖、侵襲和轉移[6-7]，本研究在此基礎上構建了裸鼠結腸癌肺轉移模型，觀察散結抑癌方對結腸癌的侵襲、轉移的影響，以及對血管內皮生長因子(VEGF)蛋白表達的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞株

BALB/c裸鼠，20只，SPF級，5周齡，雄性，平均體質量為(18±2)g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物許可證號：SCXK(滬)2017-0005。人源結腸癌HCT116熒光細胞購自中科院上海生命科學研究院細胞庫。

1.2 中藥制劑

散結抑癌方：生黃芪30 g、炒白術18 g、白茯苓18 g、制半夏9 g、炒薏苡仁30 g、藤梨根30 g、蛇舌草30 g、天龍3 g、蜈蚣3 g、甘草6 g。顆粒由江陰天江藥業有限公司提供，溶于雙蒸水配制成質量濃度約2.38 g/mL的溶液。

1.3 動物模型構建及分組

培養、消化并計數人源結腸癌HCT116熒光細胞，使用PBS稀釋細胞至1×107個/mL，取細胞懸液，固定裸鼠于小鼠固定架上進行尾靜脈注射，每只小鼠均注射200 μL細胞懸液，全過程均為無菌操作。造模成功后按小鼠體質量隨機分為對照組、中藥組、西藥組和聯合組，每組5只。貝伐珠單抗注射液[購自羅氏制藥(瑞士)有限公司]配置成質量濃度為2 mg/mL的溶液。對照組裸鼠以生理鹽水0.2 mL灌胃，1次/d，生理鹽水50 μL腹腔注射，2次/周；中藥組裸鼠以散結抑癌方0.2 mL灌胃，1次/d，生理鹽水50 μL腹腔注射，2次/周；西藥組裸鼠以貝伐珠單抗50 μL腹腔注射，2次/周，生理鹽水0.2 mL灌胃，1次/d；聯合組裸鼠以貝伐珠單抗50 μL腹腔注射，2次/周，散結抑癌方0.2 mL灌胃，1次/d。共計干預4周。

1.4 觀察指標及方法

1.4.1 轉移灶觀測 造模后使用活體動物成像儀(購自美國精諾真公司)觀測小動物轉移灶情況。造模成功后分別測量并記錄各組干預前裸鼠體質量，藥物干預開始后每4天測量并記錄1次裸鼠體質量，直至28 d干預結束。干預開始后每周進行1次小動物成像以觀察轉移灶情況，取D-熒光素鉀鹽(購自上海翌圣生物科技有限公司)，使用PBS稀釋至質量濃度為15 mg/mL的溶液，每只裸鼠予腹腔注射100 μL D-熒光素鉀鹽溶液，待10 min后使用異氟烷麻醉，麻醉后立即進行小動物成像，記錄圖像并測量生物發光光子數。

1.4.2 H-E染色 干預結束后以頸椎脫臼法處死所有裸鼠，取肺組織置于4%多聚甲醛中固定備用。固定24 h后放入包埋盒中，流水沖洗30 min，乙醇脫水后放入二甲苯中浸蠟包埋，置于病理切片機切成5 μm薄片，置于恒溫箱中烘干20 min，取出后分別于二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各脫蠟10 min，脫蠟后依次置入100%、95%、85%、75%梯度乙醇各5 min脫蠟至水，蒸餾水洗滌。切片經H-E染色后，將切片依次放入95%乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min脫水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明切片，取出晾干后以中性樹膠封片。

1.4.3 免疫組織化學染色 取裸鼠肺組織浸蠟包埋，置于石蠟切片機切成5 μm薄片，放入40 ℃溫水中受熱展開后置于恒溫箱中烘干，依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min，100%、95%、85%、75%梯度乙醇各5 min脫蠟至水，流水沖洗后加入3% H2O2浸泡10 min，清洗2次后加入檸檬酸(pH=6.0)抗原修復液(購自武漢賽維爾生物科技有限公司)，微波爐中火加熱3 min，冷卻至室溫后再次加熱、冷卻，修復抗原，水洗、PBS清洗各2次，加入血清，恒溫箱中封閉30 min，敷抗VEGF抗體(購自武漢賽維爾生物科技有限公司)，隔夜后使用PBS清洗3次，敷二抗30 min，加入DAB顯色劑，流水沖洗后浸于蘇木精中復染30 s，沖洗后各梯度乙醇、二甲苯脫水，晾干后樹膠封片。VEGF蛋白的DAB染色陽性反應表現為棕黃色顆粒，定位于細胞漿。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 散結抑癌方聯合靶向藥物改善BALB/c裸鼠體質量

裸鼠尾靜脈造模成功后測量并記錄各組裸鼠體質量，按體質量隨機分組，藥物干預開始后每日觀察裸鼠情況，每4天測量1次裸鼠體質量，藥物干預期間未出現裸鼠死亡。開始干預時觀察到各組裸鼠精神活潑，飲食飲水正常，皮膚光滑平整，體質量升高，各組間比較差異無統計學意義。干預12 d時各組裸鼠精神活潑，飲食飲水正常，裸鼠體質量達到高峰；干預12 d后各組裸鼠精神不振，飲食飲水減少，體質量均開始下降，其中對照組裸鼠皮膚出現褶皺。與干預12 d時比較，干預28 d后各組裸鼠組間差異有統計學意義(P<0.05)，其中對照組裸鼠精神萎靡，拒絕飲食飲水，皮膚毛糙褶皺，體質量下降明顯(P<0.05)；中藥組裸鼠精神不振，飲食飲水減少，皮膚稍有褶皺，體質量略高于對照組，但差異無統計學意義(P>0.05)；西藥組及聯合組裸鼠精神不振，飲食飲水減少，皮膚光滑平整，聯合組體質量略高于西藥組，但差異無統計學意義(P>0.05)，而兩組體質量均顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 散結抑癌方對小鼠體質量的影響

2.2 散結抑癌方聯合靶向藥物抑制人源結腸癌HCT116熒光細胞肺轉移

裸鼠尾靜脈造模后通過小動物成像檢測腫瘤細胞生物發光現象，觀察到轉移瘤造模成功。干預開始后每周進行1次小動物成像，觀察到干預開始時各組裸鼠均出現少量肺轉移，各組間差異無統計學意義(P>0.05)；干預結束時各組裸鼠均出現轉移(見圖2A)，對照組裸鼠轉移最明顯，出現全身轉移，轉移灶數量最多，而聯合組腫瘤轉移部位最少。定量分析結果顯示，與對照組比較，干預后中藥組、西藥組和聯合組的生物發光光子數均降低，且差異均有統計學意義(P均<0.05)，見圖2B。

注：與對照組比較，*P<0.05，***P<0.001

H-E染色結果顯示，各組裸鼠肺內均有轉移灶，且大小不一。各組均可見高核質比腫瘤細胞，核型多樣，核分裂相少量，腫瘤細胞生長旺盛，腫瘤細胞向周圍肺組織浸潤。定植于血管內的轉移灶造成血管損傷、變型。轉移灶中部由于血供不足出現壞死灶，肺泡壁輕度增厚，炎性細胞散在浸潤。對照組的轉移灶面積最大，轉移處最多，聯合組轉移灶面積最小，轉移處最少，提示散結抑癌方聯合靶向藥物抑制結腸癌轉移有較為明顯的效果。見圖3。

圖3 裸鼠肺轉移情況 H-E染色 ×100 A 對照組 B 中藥組 C 西藥組 D 聯合組

2.3 免疫組織化學染色法檢測散結抑癌方對人源結腸癌HCT116熒光細胞VEGF蛋白表達的影響

由圖4、圖5可知，對照組中VEGF蛋白平均陽性細胞率為48.57%，高于中藥組(39.91%)、西藥組(35.82%)和聯合組(29.03%)，差異均有統計學意義(P均<0.01)。

圖4 各組裸鼠肺組織中VEGF蛋白的表達 免疫組織化學染色 ×400 A 對照組 B 中藥組 C 西藥組 D 聯合組

注：與對照組比較，**P<0.01，***P<0.001

3 討論

VEGF可調控血管新生，在腫瘤的發生、發展和轉移中起著重要作用。血管新生受到包括促血管生成因子和抗血管生成因子在內的多種因子共同調控[8]。腫瘤微環境的兩大特點為慢性炎性反應和免疫抑制[9]，腫瘤細胞在開始出現時會受到免疫系統監測和攻擊，而部分腫瘤細胞可逃逸免疫系統攻擊，此時人體開始進入休眠期，休眠期將持續至免疫系統無法控制腫瘤細胞發生、發展，甚至轉移[10]。血管生成的休眠是由促血管生成因子(如VEGF)和抗血管生成因子之間的平衡引起的。

結直腸癌組織中VEGF表達水平升高、VEGF受體(VEGFR)活性升高，尤其在轉移性結直腸癌中VEGF表達水平更高[11-14]。貝伐珠單抗能與VEGF-A的亞型結合，阻斷VEGF-A與VEGFR-1和VEGFR-2之間的相互作用，從而抑制結直腸癌進展[15]。VEGF在結直腸癌中的表達有賴于腫瘤微環境的形成，中醫認為脾虛為腫瘤微環境的關鍵病機[9]。研究表明，含有健脾類中藥方劑可在一定程度上抑制結直腸癌VEGF的表達[16-17]。另有動物研究表明，蜈蚣、天龍等蟲藥的抑制腫瘤轉移作用可能與VEGF有關[18-19]。目前關于中西醫聯合用藥對VEGF表達影響的研究較少，本實驗通過尾靜脈注射結腸癌細胞建立小鼠結腸癌轉移瘤模型，觀察散結抑癌方對裸鼠結腸癌肺轉移的抑制作用，并檢測分析VEGF蛋白表達水平。研究結果指出，中西藥聯合組裸鼠體質量與對照組相比差異顯著，表明聯合用藥能有效減緩裸鼠消瘦。干預后小動物成像定量分析結果表明，散結抑癌方能減少全身轉移情況，聯合用藥后可進一步減少全身轉移情況。H-E染色結果指出，與對照組、中藥組、西藥組比較，聯合用藥組可有效減少結腸癌肺轉移。免疫組織化學檢測結果表明，散結抑癌方能在一定程度上抑制VEGF的表達，與靶向藥物聯合使用后，協同抑制VEGF的作用更強。本研究結果提示，散結抑癌方可能通過下調VEGF的表達，抑制血管新生，從而達到抑制結腸癌侵襲、轉移的目的。

綜上所述，散結抑癌方可以降低VEGF蛋白表達，在與貝伐珠單抗聯用后效果更為顯著，提示散結抑癌方與貝伐珠單抗有協同作用，可以通過降低VEGF蛋白表達，抑制血管或淋巴管生成，進一步抑制人源結腸癌HCT116熒光細胞肺轉移。目前，散結抑癌方降低VEGF蛋白表達的機制尚不完全清楚，具體有待進一步實驗證明。