高脂飲食通過胰腺Pax6信號通路誘導妊娠大鼠胰島素抵抗的機制

鄧棋芳

廣東省深圳市龍華區人民醫院產科 518110

伴隨著妊娠期糖尿病(GDM)與妊娠預后關系研究的不斷深入，關于妊娠期糖尿病(GDM)的診斷標準逐漸降低，妊娠期糖尿病的發病率進一步提升[1-2]。妊娠期糖尿病孕婦的血糖如果不能得到控制不僅會對胎兒生長發育造成不良影響，而且也會對后期的成長造成很多長期影響，例如成年期2型糖尿病的發病率會明顯提升[3-4]。妊娠期糖尿病的發生與遺傳、生活方式等很多因素具有直接關系[5]。近幾年研究發現，不良的生活方式是造成妊娠期糖尿病發病率提升的關鍵因素，比如過多的妊娠期熱量攝入、較低的體力活動會引發妊娠期體重過多增加等[6-7]。孕婦營養過剩對血糖、胰島素水平以及合成不足等所致影響及機制暫未明了。因此有必要闡明胰島β細胞在妊娠并血糖升高時的功能及分子機制[8-9]。胚胎期中樞神經系統和胰腺的發育與配對盒因子6(Pax6) 的轉錄因子具有明顯的相關性。在鼠胰腺組織內分泌細胞中可見Pax6的表達[10]。根據研究發現，小鼠胰腺α細胞分泌胰高血糖素中，Pax6的表達具有重要作用[11]。目前的研究發現，胰島β細胞功能、胰島素生物合成均有Pax6的參與[12]。為了研究高脂飲食對妊娠大鼠胰島β細胞功能及Pax6信號通路表達的影響，通過給妊娠大鼠進行高脂高熱量飲食，從而建立了妊娠大鼠糖耐量及胰島素抵抗損傷模型。從而為妊娠期高脂肪飲食致孕婦高血糖，或 GDM的發病提供理論支持，予以報告。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及其環境：8周齡雌性Wistar 未妊娠大鼠(健康清潔級)60只，體重：150～180g之間，20只雄性8周齡Wistar大鼠，體重：160～200g之間，購買于上海斯萊克有限公司。飼養條件：室溫為(22.0±1.0)℃，濕度為40%～60%，飲水自由，晝夜交替12h。

1.1.2 分組和飼料：進行適應性喂養1周后根據雌雄3∶1的比例進行合籠，于第2天晨8時對各籠雌鼠予以棉簽涂取陰道栓，鏡下予以觀察，載玻片上出現3處不同視野精子記為陽性，并作為妊娠第1天(d1) 進行記錄，未檢測到3處不同視野精子的雌鼠繼續予以合籠飼養，2周后，仍未妊娠的大鼠則進行放棄。妊娠第1天對大鼠體重進行測量，隨機分組: 高脂肪飲食組和對照組，每組30只。兩組大鼠均進行自由進水。普通飼料量配比為脂肪12.8%，糖類61.5%，蛋白質25.7%；高脂飼料糖類及脂肪分別為 40%，蛋白質20%。在-20℃冰箱內保存高脂飼料，普通飼料予以常溫環境保存。

1.2 方法

1.2.1 飼養及稱重：飼養期間，每天均需對大鼠精神狀況、活動、毛色及飲水進食情況觀察。合籠期間必須每天清晨對托盤內陰道栓情況觀察；每天記錄妊娠期間大鼠的食量，每隔2d記錄大鼠體重。

1.2.2 空腹血糖以及血清胰島素檢測：妊娠第2天(d2)及第20天(d20) ，大鼠的一般孕期為20～22d， 妊娠大鼠需要夜間禁食12h，第2天上午6—8點予以眼眶后靜脈叢取血1ml， 并對其空腹血糖(Fasting blood glucose concentration，FBG) 進行檢測(羅氏卓越型血糖儀及試紙)，取血靜置1h后低溫離心(4℃，5 000r/min，15min)，獲取上清。 將血清在-80℃的條件下冷藏，之后采用雙抗體夾心 ELISA 法對空腹胰島素水平(Fasting seruminsulin concentration，FINS)進行檢測。并對胰島素敏感指數(ISI)及HOMA模型的胰島素抵抗指數(HOMA-IR) 進行計算。ISI=1/(FBG×FINS);HOMA-IR=(FBG×FINS)/22.5。

1.2.3 葡萄糖耐量試驗(Oral glucose tolerance test，OGTT)和胰島素釋放試驗(Insulin release test，IRT):妊娠第20天取血進行 FGB、FINS的檢測后，根據2.0g/kg體重采用50%葡萄糖進行灌胃，在葡萄糖負荷后的0、15、30、60min，分別對大鼠尾靜脈取血約0.5ml并對血糖及血清胰島素水平測定。

1.2.4 標本取材:妊娠第20天取血后，頸椎脫臼處死后開腹獲取胰腺組織，試驗需在冰上進行，接觸組織的器械都需要進行無 RNA 酶處理，之后分別取3～5mm放到無 RNA 酶的 EP 管中，采用液氮速凍，保存在-80℃冰箱。

1.2.5 Western blot檢測相關蛋白的表達:取液氮凍存好的胰腺組織，將其研磨成粉末，進行充分裂解30min后，在4℃的條件下進行12 000×g離心30min，提取上清。應用BCA蛋白活性測定將30μg蛋白進行10% SDS-PAGE，將電泳分離好的蛋白轉移到硝酸纖維素膜(PVDF)上，在室溫條件下在5%脫脂牛奶中進行反應1h，進行充分洗滌后分別添加一抗小鼠抗人胞Pax6單克隆抗體(1∶1 000)兔抗鼠Pdx1多克隆抗體(1∶1 000)以及兔抗人MafA單克隆抗體(1∶1 000)后，在4℃的條件下反應過夜，進行充分洗滌后添加二抗辣根過氧化物酶(HRP) 標記的山羊抗兔IgG(1∶10 000) 或辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG(1∶10 000)，在室溫條件下反應30min，進行充分洗滌后，采取ECL化學發光液反應1min，采用全自動數碼凝膠圖像分析系統進行拍照觀察。

2 結果

2.1 高脂飲食對妊娠大鼠孕期體重影響 高脂飲食組大鼠孕期體重高于同期對照組大鼠，且高脂飲食組大鼠妊娠第13 天、19天體重均明顯高于同期對照組，具有顯著性差異(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體重變化比較

2.2 高脂飲食對妊娠大鼠的 FBG、FINS的影響 大鼠妊娠第 20 天時， 高脂飲食組妊娠鼠的 FBG明顯高于對照組，具有顯著性差異(P<0.05)，且產生高血糖癥狀；高脂飲食組妊娠鼠的FINS與對照組進行比較，無顯著差異(P>0.05)。見表2。

表2 高脂飲食對妊娠大鼠的FBG、FINS的影響

2.3 高脂飲食對妊娠大鼠的ISI、HOMA-IR水平的影響 對高脂飲食對妊娠大鼠的ISI、HOMA-IR的影響的研究發現，大鼠妊娠第20天時， 高脂飲食組妊娠大鼠的HOMA-IR明顯高于對照組，具有顯著性差異(P<0.05)。而高脂飲食組妊娠大鼠ISI與對照組進行比較，則不具有顯著差異(P>0.05)。見表3。

表3 高脂飲食對妊娠大鼠的 FBG、FINS的影響

2.4 高脂飲食對不同時間段妊娠大鼠OGTT的影響妊娠 對高脂飲食對不同時間段妊娠大鼠OGTT的影響進行研究發現，大鼠妊娠第20天時，高脂飲食組妊娠大鼠OGTT各時間點的血糖值均明顯高于對照組，具有顯著性差異(P<0.05)。見表4。

表4 高脂飲食對不同時間段妊娠大鼠OGTT的影響

2.5 高脂飲食對不同時間段妊娠大鼠IRT的影響 IRT的試驗結果發現，高脂飲食組妊娠大鼠0min、15min、30min、60min時間點胰島素釋放水平均低于對照組，15min、30min、60min時統計學差異明顯(P<0.05)。見表5。

表5 高脂飲食對不同時間段妊娠大鼠 IRT 的影響

2.6 高脂飲食對妊娠大鼠胰腺Pax6蛋白及其相關蛋白表達的影響 高脂飲食對妊娠大鼠胰腺 Pax6蛋白及其相關蛋白表達的影響研究表明，在妊娠晚期(d20)，高脂飲食組妊娠大鼠胰腺 Pax6蛋白及其相關蛋白Pdx1、MafA的表達均明顯低于對照組，具有顯著性差異(P<0.05)。見表6及圖1～3。

圖1 蛋白質印跡法檢測妊娠大鼠胰腺 Pax6表達水平

表6 高脂飲食對妊娠大鼠胰腺 Pax6 及其靶基因表達的影響

3 討論

最近國內外專家的研究發現，在妊娠期糖尿病的發病中，飲食因素具有十分關鍵的作用[13-14]。很多研究人員從營養因素進行探索，希望可以發現預防妊娠期糖尿病發生、抑制妊娠期糖尿病發展并緩解妊娠期糖尿病結局的最好方法[15]。目前研究發現，胰島β細胞功能損傷與GDM的發生具有直接關系，β 細胞的分化以及功能會受到很多轉錄因子調節，如Pax4、Pdx1、MafA、Pax6 等，目前這些轉錄因子之間存在的聯系已經在動物實驗中得到證明[16-17]。Kanwar P等研究示：敲除 Pax6鼠胰腺內分泌細胞的個數雖然沒有顯著改變，但鼠內分泌功能會受到嚴重損傷[18]。對于維持胰島細胞功能，尤其是α和β細胞的分化，Pax6具有關鍵的意義。Pax6基因在小鼠胰腺發育的早期及成熟的內分泌細胞中大量表達，研究表明對胰腺α細胞的分化，Pax6基因的表達十分關鍵[19]。并且最近的研究發現，Pax6 對β細胞關鍵基因編碼蛋白的轉錄可進行調控，從而影響胰島素生物合成及釋放。Pax6也能夠特異性的調控與胰島素基因轉錄的主要蛋白的表達[20]。胰十二指腸同源盒因子1(Pancreatic and duodenal homeobox factor-1，Pdx1) 能參與胰腺早期發育及成熟期β細胞分化。Pdx1在成熟的機體內可以通過很多蛋白的表達，從而調節β細胞功能，特別是對胰島素及胰島素相關基因進行調節[21]。在血糖調控胰島素蛋白表達的過程中，MafA具有重要作用，葡萄糖濃度能夠調控MafA的表達水平以及功能。MafA在糖尿病的狀態下，其表達量會出現減弱，從而對胰島素的合成和分泌造成影響。目前的研究發現，MafA基因缺陷小鼠的Pdx1和GLUT2的蛋白表達水平都出現降低，說明MafA是葡萄糖刺激下胰島素分泌的一種重要調控蛋白[22]。

圖2 蛋白質印跡法檢測妊娠大鼠胰腺 Pdx1表達水平

圖3 蛋白質印跡法檢測妊娠大鼠胰腺 MafA表達水平

實驗對妊娠期大鼠應用高脂肪飲食喂養，誘導產生糖耐量異常及胰島素抵抗，這種防范已經廣泛應用于2型糖尿病動物實驗，并證明高脂飲食可誘發2型糖尿病。同時發現在妊娠晚期(d20)，高脂飲食組FBG、HOMA-IR明顯高于對照組，OGTT、IRT也有不同程度異常，Pax6蛋白及其相關蛋白Pdx1，MafA的表達均明顯下降。推測機體在高血脂以及高血糖的情況下，Pax6屬于基因轉錄調節的關鍵因子。

綜上所述，對妊娠期大鼠高脂及高熱卡飲食致其產生糖耐量異常以及胰島素抵抗，推測是由Pax6蛋白及其相關蛋白Pdx1、MafA表達變低所導致，從而在一定程度上揭示了孕婦孕期營養過剩容易發生妊娠期糖尿病的機制。本研究可為妊娠期孕婦營養膳食提供理論依據，為妊娠期糖尿病以及具有高危風險的孕婦提供合理膳食指導，因國內外對此研究較少，其機制和后續信號通路還需要進行下一步的研究驗證。