HPLC法同步測定莓茶中二氫楊梅素、楊梅苷、楊梅素含量

張學英

（湘西自治州食品藥品檢驗所，湖南 吉首 416000）

莓茶學名顯齒蛇葡萄，為葡萄科蛇葡萄屬顯齒蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata），同義名稱有藤茶、茅巖莓、神仙草等。莓茶是一種野生藤本植物，廣泛分布于我國湖南、湖北、廣西、貴州等省份，其中湖南省野生及人工種植莓茶集中在湘西土家族苗族自治州（以下簡稱湘西州）和張家界市。湘西州莓茶種植歷史悠久，有“溪洲莓茶”“永順莓茶”等標志產品[1-2]。顯齒蛇葡萄葉為藥食兩用物質，其藥用成分為蛇葡萄素、楊梅素、楊梅苷、沒食子酸、豆甾醇等[3]；具有清熱解毒、利濕消腫功效，可用于治療感冒發熱、咽喉腫痛、濕熱黃疸、目赤腫痛、癰腫瘡癤[4]；2013年12月24日，原國家衛生和計劃生育委員會將顯齒蛇葡萄葉納入可用于食品生產加工的新食品原料管理[5]，2019年國家衛生健康委員會將顯齒蛇葡萄葉列入最新版食藥同源目錄[6]，由此顯齒蛇葡萄葉（即莓茶葉）的食藥兩用功效被廣為人知。近年來莓茶代用茶產業因投入少、周期短、見效快、利潤價值空間大等特點，己成為湘西州永順縣和鳳凰縣落實脫貧攻堅和鄉村振興戰略而大力扶持的項目，莓茶被列為湘西州茶葉產業地方政策重大項目之一，廣大科研工作者對莓茶的開發應用進行了深入研究。例如，莓茶代用茶的研制、莓茶中藥用成分的具體功效研究等[7-17]。另外，還有很多學者對莓茶中主要活性成分如總黃酮、二氫楊梅素等檢測分析方法進行了研究[18-22]，以及地方政府頒布了相關內容的地方標準[23-24]。

目前，關于莓茶中特征物質二氫楊梅素、楊梅苷及楊梅素的單獨檢測方法已有較多報道，但同時檢測3種黃酮單體的方法尚未見報道。因此，筆者通過標準品定性、高效液相色譜儀外標法定量、線性關系考察及方法學評價等過程，建立一套準確度高、樣品處理簡便、上機檢測靈敏度高和重現性好的莓茶代用茶中特征物質（二氫楊梅素、楊梅苷及楊梅素）的同步檢測方法，以期為莓茶代用茶的開發應用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗樣品來源于湖南省市場監督管理局，為2020年湖南省永順縣、鳳凰縣、古丈縣、張家界市、湖北省恩施州等地不同季節制成的莓茶成品以及湖南省永順縣部分鄉鎮野生莓茶。試驗前樣品需進行簡單前處理，即60℃恒溫復干1 h→粉碎→備用。3種黃酮單體標準品分別是二氫楊梅素（CAS號27200-12-0，分子式C15H12O8，純度99.5%）、楊梅苷（CAS號17912-87-7，分子式C21H20O12，純度98.5%）和楊梅素（CAS號529-44-2，分子式C15H10O8，純度99.8%），由上海源葉生物科技有限公司生產。

主要試劑有甲醇（TEDIA牌，含量≥99.9%）、乙腈（TEDIA牌，含量≥99.9%）、磷酸（科密歐牌，含量≥85.0%）等，均為色譜純。

主要儀器有高效液相色譜儀（島津20AT，帶自動進樣裝置、PAD全波長檢測器和可選擇波長分析系統）、BSA-224S感量0.000 1 g分析天平、JY502感量0.01 g電子天平、KQ5200V型超聲波清洗器等。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液配制 稱取干燥恒重二氫楊梅素0.015 5 g于小燒杯中，用甲醇溶解定容至25 mL棕色容量瓶中（必要時可常溫超聲助溶），稱重冷凍貯存（常溫稱重，并用甲醇補至衡重），得標準溶液Ⅰ，二氫楊梅素標準溶液濃度為620 μg/mL，使用時用初始流動相，將其稀釋成標曲系列Ⅰ，二氫楊梅素濃度，依次為62、155、310、465、620 μg/mL。稱取干燥恒重楊梅苷0.007 5 g和楊梅素0.006 9 g于小燒杯中，用甲醇溶解定容至100 mL棕色容量瓶中（必要時可常溫超聲助溶），稱重冷凍貯存（常溫稱重，并用色譜純甲醇補至衡重），得標準溶液Ⅱ，楊梅苷和楊梅素混合標準溶液濃度分別為75和69 μg/mL，使用時用初始流動相，將其稀釋成標曲系列Ⅱ，楊梅苷濃度依次為7.5、18.75、37.5、56.25、75 μg/mL，楊梅素濃度依次為6.9、17.25、34.5、51.75、69 μg/mL。

1.2.2 標準曲線繪制 標曲系列Ⅰ、Ⅱ分別進樣20 μL上機檢測，二氫楊梅素、楊梅苷和楊梅素的檢測波長分別為290 、350和370 nm，以標準溶液濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標繪制標準曲線，獲取標準曲線方程及相關系數。

1.2.3 色譜條件 色譜柱C18（4.6×250 mm，5 μm）或等效柱；標曲系列Ⅰ、Ⅱ進樣量20 μL；樣品進樣量10 μL；檢測柱溫35℃；檢測時間約41 min；流動相A為0.1%磷酸水溶液，流動相B為乙腈，按表1進行梯度洗脫。

表1 檢測時間和流動相A、B比例

1.2.4 樣品峰定性試驗 以標準品作為待測物定性溯源的依據，在樣品處理液中依次加入微量標準品再上機檢測（加入順序為楊梅素、楊梅苷和二氫楊梅素），看相應出峰時間及峰面積的增大情況。

1.2.5 檢測分析方法驗證 （1）精密度試驗。選取標曲系列Ⅰ、Ⅱ中間點濃度溶液連續進樣檢測5次，考察各單體的峰面積，分析該方法的精密度。（2）重現性試驗。準確稱取10號莓茶試驗樣品0.5 g 共5份，按試驗方法進行樣品檢測，分析該方法的重現性。（3）標準溶液穩定性試驗。①短期穩定性。分別于標準溶液Ⅰ、Ⅱ配置后1、173、345、517和689 min（約11 h）取樣檢測，考察各單體峰面積的變化情況。②長期穩定性。分別于標準溶液配制后當天、1、2、3、4個月取標曲系列Ⅰ、Ⅱ中間點濃度溶液進行分析檢測，考察各單體峰面積的變化情況。（4）加標回收試驗。精確稱取10號試驗樣品0.553 7 g，用30 mL70%甲醇超聲提取，提取液用初始流動相按1：25稀釋；以試劑做空白樣，空白樣直接提取定容至25 mL；在試驗樣品和空白樣中分別加入標準溶液Ⅰ、Ⅱ各10 mL，按試驗方法檢測3種黃酮單體的加標回收率。（5）檢測限試驗。采用不同濃度標準溶液進行檢測，通過色譜峰形確定方法的上下檢測限。

1.2.6 樣品檢測 準確稱取莓茶粉碎樣品0.5 g（準確至0.000 1 g）至50 mL比色管中，先準確加入15 mL70%甲醇水溶液潤濕混勻，再準確加入15 mL70%甲醇水溶液沿壁洗凈，稱重記數，混勻置于50℃超聲儀中超聲提取30 min，取出冷卻至室溫再次稱重，并用純甲醇補至超聲提取前的重量（即衡重衡定體積），混勻過0.45 μm濾膜，上機檢測楊梅苷和楊梅素；另將超聲提取液用初始流動相（乙腈∶0.1%磷酸水溶液=15∶85）進行1∶10稀釋，混均過0.45 μm濾膜，上機檢測二氫楊梅素；結果取平均值。

1.2.7 結果計算 根據標準曲線方程，計算出所測樣品處理液中二氫楊梅素、楊梅苷和楊梅素濃度含量。再按公式（1）計算樣品中黃酮單體含量。

其中，C為二氫楊梅素、楊梅苷和楊梅素的含量；C’為樣品處理液中二氫楊梅素、楊梅苷和楊梅素濃度（μg/mL），由峰面積值代入標準曲線方程而得出；V為70%甲醇提取液體積數（mL）；1 000為單位換算系數；F為稀釋倍數；M為樣品稱樣量（g）。

2 結果與分析

2.1 3種黃酮單體的標準曲線方程

由圖1可知，在62～620 μg/mL范圍內二氫楊梅素的標準曲線方程為C’=0.018 1×S-2.761 7，相關系數R2=0.999 8；在7.5～75.00 μg/mL范圍內楊梅苷的標準曲線方程為C’=0.025 9×S-0.249 8，相關系數R2=0.999 9；在6.9～69.00 μg/mL范圍中楊梅素的標準曲線方程為C’=0.013 6×S-0.287 5，相關系數R2=0.999 9。3種黃酮單體的線性回歸方程相關系數均接近1，且均在95%可置信區間內，說明該方法適用于二氫楊梅素、楊梅苷和楊梅素3種黃酮單體的檢測。

圖1 3種黃酮單體的標準曲線方程及相關系數

2.2 系統適用性考察

由表2可知，二氫楊梅素、楊梅苷、楊梅素3種黃酮單體的出峰時間分別為18.34、27.83和34.54 min，3種物質出峰時間差距較大，不會相互影響；色譜柱理論塔板數n（即色譜柱的分離效能）分別為6 243、92 587和182 942，均遠遠大于4 000，說明色譜柱分離效能高達液相色譜方法檢測要求；相鄰峰分離度R分別為2.785、2.267和2.707，均大于1.5，證明前后峰出峰不影響；拖尾因子T （即色譜峰的對稱性）分別為0.961、1.007和1.030，其值均在0.95～1.05之間，說明色譜峰無拖尾峰形對稱。綜合分析得出該檢測方法系統適用性考察符合標準要求[25]。

表2 系統適用性試驗檢測結果及數據分析

2.3 樣品峰定性

由表3可知，序號1～3未加二氫楊梅素，其峰面積RSD值（n=3）為1.361 8%；序號2～4己加了楊梅素，其峰面積RSD值（n=3）為1.119 2%；序號1～2未加楊梅苷，其峰面積相對平均偏差為0.961 5%；序號3～4己加楊梅苷，其峰面積相對平均偏差為2.522 9%。RSD值或相對平均偏差均小于5%，說明檢測結果數據穩定；同時添加標準品前后各單體的峰形和相應出峰時間均無變化，僅相應峰面積增大，表明標準品定性溯源準確。

表3 樣品峰定性試驗結果

2.4 方法學評價

2.4.1 精密度 由表4可知，3種黃酮單體連續進樣時響應值峰面積（即精密度）RSD值均小于5.0%，可見該檢測方法精密度很高，檢測儀器穩定。

表4 精密度試驗檢測數據及結果分析（n=5）

2.4.2 重現性 由表5可知，莓茶樣品中二氫楊梅素、楊梅苷和楊梅素重復檢測RSD值均小于5.0 %，說明該試驗方法檢測結果穩定，重現性好。

表5 重現性試驗檢測數據及結果分析（n=5）

2.4.3 標準溶液穩定性 由表6可知，3種黃酮單體峰面積RSD值均小于 5.0 %，說明標準溶液濃度在11 h內穩定不變，溶液穩定性良好。由表7可知，3種黃酮單體的峰面積RSD值均小于5.0%，說明標準溶液濃度在較長時間內能保持穩定。

表6 標準溶液11 h穩定性試驗結果（n=5）

表7 標準溶液4個月穩定性試驗結果（n=5）

2.4.4 加標回收率 試驗結果顯示，空白樣中二氫楊梅素、楊梅苷和楊梅素的加標回收率分別為101.415 6%、97.817 7%和90.052 2%；試驗樣品中二氫楊梅素、楊梅苷和楊梅素的加標回收率分別為97.542 7%、94.911 7%和90.182 1%；空白樣和試驗樣品加標回收率均在90%～105%之間，表明該檢測方法目標物損失少、人為影響因素小、加標回收率高、檢測結果準確。

2.4.5 上下檢測限 試驗結果顯示，當二氫楊梅素、楊梅苷和楊梅素檢測濃度分別約為775、130和120 μg/mL時，峰面積約為33 950 000、5 044 000和8 900 000 mAU*s，其色譜峰形開始出現拖尾現象，峰對稱性變較差，峰頂現小饅頭峰，此濃度下浮20%確定為檢測上限濃度，分別為620、104和96 μg/mL；當二氫楊梅素、楊梅苷和楊梅素檢測濃度分別約為3.1、3.75和3.45 μg/mL時，峰面積約為166 000、149 000和246 000 mAU*s，其色譜峰形較小，響應值低，光譜圖不明顯，此濃度上浮20%確定為檢測下限濃度，分別為3.72、4.5和4.14 μg/mL。

2.5 樣品檢測

由表8可知，莓茶樣品中3種黃酮單體成分含量較高，其中二氫楊梅素含量在249.864～337.551 g/kg，楊梅苷和楊梅素含量分別為2.981 5～9.919 1和0.459 5～3.367 7 g/kg。

3 結論與討論

通過標準品定性、高效液相色譜儀外標法定量、線性關系考察及方法學評價等過程建立了基于HPLC的二氫楊梅素、楊梅苷、楊梅素3種黃酮單體的同步測定方法。結果表明：二氫楊梅素在62～620 μg/mL范圍呈良好的線性關系，相關系數0.999 8，精密度、重現性和穩定性RSD均小于5%，加標回收率在90%～105%；楊梅苷在7.5～75 μg/mL范圍呈良好的線性關系，相關系數0.999 9，精密度、重現性和穩定性RSD均小于5%，加標回收率在90%～105%；楊梅素在6.9～69 μg/mL范圍呈良好的線性關系，相關系數0.999 9，精密度、重現性和穩定性RSD均小于5%，加標回收率在90%～105%；用此法檢測12批次莓茶代用茶樣品，發現樣品中二氫楊梅素含量為249.864～337.551 g/kg；楊梅苷和楊梅素含量分別為2.981 5～9.919 9和0.459 5～3.367 7 g/kg。

用該方法可以同時完成莓茶代用茶中二氫楊梅素、楊梅苷和楊梅素這3種黃酮單體的有效分離、正確定性和準確定量，標準曲線線性良好，可以在莓茶代用茶質量控制、藥物應用研究、生產工藝研究及產品開發利用中加以應用。