超聲輔助酶法提取金銀花多糖的工藝優(yōu)化

呂 欣，譚春玲，麥名娜，林容芳,張美霞

（重慶文理學院林學與生命科學學院，重慶 402160）

金銀花為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonicaThunb）的干燥花蕾或初開的花，其藥用歷史悠久，是清熱解毒、涼散風熱的良藥[1]，一般用于治療癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風熱感冒、溫病發(fā)熱[2]和降血脂、降血糖[3]等。金銀花多糖是金銀花的主要活性成分之一[4]。近代研究表明，植物多糖具有抗腫瘤、降血糖、抗補體、抗氧化性[5-9]等生理活性，可應用于化妝品、保健品[10]等領域，具有一定的開發(fā)價值。常用的金銀花多糖提取方法有水提法、超聲提取法、水提醇沉法等，其多糖得率較低。周小楠等[11]采用酶法提取金銀花多糖可顯著提高多糖得率，趙鵬等[12]采用超聲法提取金銀花多糖，與傳統(tǒng)水提法相比，超聲提取時間可縮短2/3左右。目前，未見超聲法與酶法聯用提取金銀花多糖的相關報道。因此，筆者以金銀花為原材料，采用超聲波輔助酶法提取金銀花多糖，通過單因素試驗及響應面分析法對多糖的提取工藝進行優(yōu)化，探索超聲輔助酶法提取金銀花多糖的最佳工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試金銀花來自康美藥業(yè)股份有限公司。主要試劑有纖維素酶（10萬U/g，和氏璧生物科技有限公司），葡萄糖、無水乙醇、丙酮、乙醚、苯酚（國藥集團化學試劑有限公司），濃硫酸、鹽酸（重慶川東化工有限公司）。主要儀器設備有752 紫外可見分光光度計（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）、XMTD-204 數顯式電熱恒溫水浴鍋（上海龍躍儀器設備有限公司）、SB-5200DTDN 超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）、電熱恒溫鼓風干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械有限公司）、TGL-21 高速冷凍離心機（四川蜀科儀器有限公司）、DS-T300 高速多功能粉碎機（上海頂帥電器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 金銀花多糖的提取方法 對周小楠等[11]提取方法進行改良。稱取約10 g金銀花粉末，按照要求的單因素條件進行超聲提取，用8層紗布過濾，調節(jié)提取液pH值，酶解溫度50℃，加入纖維素酶酶解1 h后100℃高溫滅活10 min，4 000 r/min條件下離心20 min進行分離，棄去沉淀，用鹽酸法[13]除蛋白，濃縮至原液體積的約1/10后加入4倍無水乙醇醇沉一夜，有絮狀物析出，抽濾，濾餅依次用乙醇、丙酮、乙醚淋洗，干燥得金銀花多糖。

1.2.2 金銀花多糖含量的測定 （1）標準曲線的繪制。采用苯酚-硫酸法[14]測定多糖的含量。稱取干燥至衡重的葡萄糖標準品0.1 g至100 mL容量瓶并用蒸餾水定容，制得1.0 mg/mL的葡萄糖標準溶液；取上述配制的葡萄糖標準液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL至100 mL容量瓶；定容至刻度，混勻，制得濃度分別0、20、40、60、80、100 μg/mL的葡萄糖標準溶液。從上述已配制各濃度葡萄糖標準液中分別取出2 mL于試管中，加入5%苯酚溶液1 mL，再迅速加入5 mL濃硫酸，搖勻，室溫靜置40 min，在490 nm下測定溶液的吸光度值。以葡萄糖濃度為橫坐標（X），吸光度值為縱坐標（Y），繪制標準曲線。獲得苯酚-硫酸法測定多糖濃度的標準曲線方程為：Y=0.007 3X-0.019 7，R2=0.992 7。（2）樣品多糖含量的測定。按苯酚-硫酸法[14]稱取0.01 g樣品多糖于200 mL容量瓶中，定容至刻度，吸取2 mL溶液于試管中，加入5%苯酚溶液1 mL，再迅速加入5 mL濃硫酸，搖勻，室溫靜置40 min，在490 nm下測定溶液的吸光度值。多糖得率按下列公式計算。

式中，W為金銀花多糖的得率（%）；C為從回歸曲線中計算得出的糖濃度（mg/mL）；V為定容體積（mL）；M1為金銀花粗多糖質量（mg）；M2為金銀花原料質量（干花粉末，mg）；M3為配置金銀花粗多糖溶液時稱取的質量（mg）。

1.2.3 單因素試驗 精確稱取經粉碎過的金銀花粉末10.0 g，參考周小楠等[11]及胡琴漢等[15]研究結果，設定酶解溫度50 ℃、酶解時間為1 h固定不變，以超聲時間60 min、超聲溫度50℃、超聲功率200 W、料液比1∶20（g/mL）、酶添加量1.5%、酶解pH值5為試驗常規(guī)量，分別考察超聲時間（20、40、60、80、100 min）、超聲溫度（40、50、60、70、80℃）、超聲功率（40、80、120、160、200 W）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL）、酶添加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、酶解pH值（3、4、5、6、7、8）對金銀花多糖得率的影響，每個處理設3次平行試驗，從而確定上述6個因素的最佳參數。

1.2.4 響應面設計 結合單因素試驗結果，采用Design-Expert 8.0.6軟件進行Box-Behnken設計，分別選取酶用量（X1）、超聲溫度（X2）、料液比（X3）這3個對金銀花多糖得率影響較為顯著的因素為自變量，以金銀花多糖得率為響應值（Y），進行三因素三水平[16-17]試驗。試驗設計因素及水平見表1。

表 1 響應面分析法的因素及水平

1.3 數據處理

試驗數據采用SPSS 22.0軟件進行單因素試驗方差分析（方差同質性檢驗），用Excel 2010軟件作圖，采用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結果進行響應面優(yōu)化，所有數據均重復測定3次，結果取平均值。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料液比對金銀花多糖得率的影響 如圖1所示，多糖得率隨著料液比的增加而明顯增高，這是因為隨著水溶劑的增多，多糖可以充分溶出；在料液比為1∶50時，多糖得率最大；而料液比為1∶60時，多糖得率有下降趨勢，這是由于水溶劑的增多，可能導致其他雜質溶出，導致溶出的多糖迅速在水中溶解[18]，且料液比過大可導致后期處理的損失增多，從而降低了多糖的得率。因此，確定最佳料液比為1∶50（g/mL）。

圖1 不同料液比處理金銀花多糖的得率

2.1.2 超聲時間對金銀花多糖得率的影響 如圖2所示，隨著超聲時間的延長，多糖得率呈上升趨勢，超聲時間為60 min時，多糖得率最大，超過60 min后，多糖得率降低，可能是因為超聲波具有較強的剪切作用[19]，時間過長會破壞多糖的分子結構[20]，促使多糖在外力作用下發(fā)生水解反應，從而降低多糖含量，影響得率。因此，確定最佳超聲時間為60 min。

圖2 不同超聲時間處理金銀花多糖的得率

2.1.3 超聲溫度對金銀花多糖得率的影響 如圖3所示，隨著超聲溫度的升高，擴散作用隨之增強，分子運動更加劇烈，多糖得率有升高的趨勢，但超過50℃后，多糖得率出現了明顯的下降，可能是由于高溫和超聲波破碎的協(xié)同作用導致部分金銀花多糖的結構被破壞和降解[21]，且溫度過高容易造成溶劑氣化，不利于溶劑與物料的接觸，從而影響多糖得率[22]。因此，確定最佳超聲溫度為50℃。

圖3 不同超聲溫度處理金銀花多糖的得率

2.1.4 超聲功率對金銀花多糖得率的影響 如圖4所示，隨著超聲功率的增大，多糖得率呈上升趨勢，超聲功率為200 W時，多糖得率最高，但得率增加并不明顯，說明該因素對多糖得率的影響不大。因此，確定最佳超聲功率為200 W。

圖4 不同超聲功率處理金銀花多糖的得率

2.1.5 酶解pH值對金銀花多糖得率的影響 如圖5所示，隨著酶解pH值的增大，多糖得率先升高后下降，當酶解pH值為6時，多糖的率最高。這是因為酶解pH值主要作用于纖維素酶，而纖維素酶發(fā)揮酶活性的最適pH值為4.5～6.5，當提取液的pH值接近纖維素酶的最適pH值時，酶活性較大[23]。而多糖提取液的pH值為5，從簡化試驗的角度，確定最佳酶解pH值為5。

圖5 不同酶解pH值處理金銀花多糖的得率

2.1.6 酶用量對對金銀花多糖得率的影響 如圖6所示，隨著酶用量的增加，多糖得率不斷升高，是因為加入纖維素酶導致細胞壁破壞，進一步溶出多糖，且酶用量越多，酶與底物的反應越充分，酶用量超過2.5%，多糖得率有下降趨勢，因為酶與底物已經充分反應[24]，多余的酶不與底物作用，還有可能導致多糖降解[25]，使雜質溶出。因此，確定最佳酶用量為2.5%。

圖6 不同酶用量處理金銀花多糖的得率

2.1.7 單因素顯著性差異分析

由SPSS22.0軟件單因素方差分析得出，料液比、超聲時間、超聲溫度、超聲功率、酶用量、酶解pH值對金銀花多糖得率影響的P值分別為0.000、0.202、0.037、0.920、0.044、0.932；其中，料液比對多糖得率有極顯著影響，超聲溫度、酶用量對多糖得率有顯著影響，而超聲時間、超聲功率、酶解pH值對多糖得率的影響不顯著。因此，選擇料液比、超聲溫度、酶用量這3個因素進行Box-Behnken試驗設計。

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗設計與結果 根據Box-Behnken試驗設計原理，結合單因素試驗結果，得出響應面方案與試驗結果（表2）。

表2 響應面設計方案與試驗結果

2.2.2 模型建立與顯著性檢驗 用Design-Expert 8.0.6軟件對表2數據進行回歸擬合，得到回歸擬合方程為：Y=55.12+1.84X1+0.53X2-2.51X3-0.27X1X2-2.49X1X3+0.58X2X3-8.47X12-2.49X22-9.93X32。其中，Y為多糖得率，X1為酶用量，X2為超聲溫度，X3為料液比。

從表3可以看出，模型P值為0.000 2＜0.01，是極顯著的，且失擬項P=0.093 9＞0.05，不顯著，R2=0.967 8，表明該模型擬合效果好[26]，試驗誤差較小，Radj2=0.926 4，表示有92%的響應值變化可以用該模型解釋，同時也可以用該回歸方程預測提取率與多糖得率的關系，可信度較高。從表3還可以得出，3個因素對多糖得率的影響由大到小排列依次為X3（料液比）＞X1（酶用量）＞X2（超聲溫度）；X1和X3及X1X3影響顯著 （P＜0.05），X12、X32影響高度顯著（P＜0.000 1），X2、X1X2、X2X3和X22影響不顯著。

表3 方差分析結果

2.2.3 響應面圖分析 曲面圖和等高線的形狀可直觀反映出料液比、酶用量及超聲溫度3個因素對金銀花多糖得率的影響。由圖7可知，任何2個交互因素都存在最大響應值。由圖7A可知，當料液比一定時，多糖得率隨著酶用量的增加而呈現先增大后減小的趨勢，隨著超聲溫度的升高呈現平緩增大的趨勢；從等高線形狀可看出，酶用量和超聲溫度的交互作用對多糖得率影響不顯著，同時可以得出，酶用量對多糖得率的影響大于超聲溫度。由圖7B可知，當超聲溫度一定時，多糖得率隨著酶用量的增大呈現先增大后減小的趨勢，隨著料液比的增大呈現先增大后減小的趨勢；從等高線形狀可看出，料液比和酶用量的交互作用對多糖得率的影響較顯著，同時可得出，料液比對多糖得率的影響大于酶用量。由圖7C可知，當酶用量一定時，多糖得率隨著超聲溫度的升高而平緩增大，隨著料液比的增大而呈現先增大后減小的趨勢，等高線的形狀可看出，料液比和超聲溫度的交互作用對多糖得率影響不顯著，同時可以得出，料液比對多糖得率的影響大于超聲溫度。從圖7還可以看出，圖7B的3D響應曲面最為陡峭[27-29]，且等高線最為密集，其次為圖7C。因此，可判斷料液比與酶用量的交互作用對多糖得率的影響最大，其次為料液比與超聲溫度的交互作用的影響。綜合來看，3個單因素對多糖得率影響的順序表現為料液比＞酶用量＞超聲溫度，與方差分析表結果相符。

圖7 不同因素交互作用對金銀花多糖得率影響的響應面與等高線圖

2.2.4 驗證試驗 通過Design-Expert 8.0.6軟件分析，得出提取金銀花多糖的最優(yōu)工藝為：料液比1∶48（g/mL），超聲溫度50.83 ℃，酶用量2.56%，金銀花多糖的得率預測值為55.432 7%。根據實際情況對工藝進行修正，修正后的試驗條件為：料液比1∶48（g/mL），超聲溫度50.80 ℃，酶用量2.56%，在此條件下進行3次平行試驗進行驗證，得到的金銀花多糖平均得率為54.275%，與回歸模型預測的理論值相近，進一步說明該模型可靠。

3 結 論

采用超聲法與酶法聯用提取金銀花多糖，相比傳統(tǒng)的水提法，具有節(jié)約時間和提高多糖得率的優(yōu)點。通過響應面優(yōu)化法分析得出在料液比1∶48（g/mL），超聲溫度50.80 ℃，酶用量2.56%，超聲時間60 min，超聲功率200 W，酶解pH值為5的條件下，金銀花多糖平均得率為54.274 9%。與已有文獻相比，該方法大大提高了金銀花多糖得率，可為金銀花多糖的工廠化提取以及金銀花多糖生物活性與化學結構的進一步研究奠定基礎。