氧化應激介導的DNA損傷在大鼠心肌H9C2細胞缺氧/復氧損傷中的作用*

駱佳銘，李 機，趙 偉

(南方醫科大學珠江醫院麻醉科，廣州 510282)

心肌缺血-再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)是圍術期面臨的一種常見病理生理變化，嚴重威脅患者生命安全[1-2]，其發病機制仍不清楚。前期研究表明MIRI是多種因素共同作用的結果[3-4]，在急性心肌缺血再灌注狀態中氧化應激發揮了顯著破壞作用[5-6]。當發生心肌缺血再灌注時，活性氧(reactive oxygen species,ROS)暴發超過了機體捕獲清除的能力時可破壞細胞膜結構的完整性，造成MIRI。氧化應激是如何導致MIRI后心肌細胞損傷和死亡，至今尚不明確。

相關研究表明，氧化應激是導致細胞DNA損傷的重要因素之一[7]。DNA 作為生物體最重要的遺傳物質，其穩定性決定了生物的生存和發展。但生物體本身基因的完整性容易受內、外環境因素影響，輻射線的傷害或化學試劑的破壞均可導致DNA 的雙鍵結構斷裂而造成損傷。前期研究發現，MIRI過程中心肌細胞內ROS水平增高[6,8-9]。由此推測，MIRI病理過程中氧化應激產生的ROS很可能是導致心肌細胞DNA損傷的重要因素。

本研究在大鼠心肌H9C2細胞缺氧/復氧模型上檢測細胞內氧化應激導致的DNA損傷，并通過加入抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)論證由氧化應激導致的DNA損傷在MIRI發病過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠心肌H9C2細胞購自中科院上海細胞庫(目錄號GNR 5)；一抗Bcl-2(貨號：#3498)、Bax(貨號：#1479)、Cytochrome c(貨號：#12963)、Phospho-Histone H2A.X (S139)(貨號：#9718S)和β-actin(貨號：#4967)抗體購自美國CST公司；8-OHdG(貨號：#sc-66036)抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養

大鼠心肌H9C2細胞是來源于胚胎期BD1X大鼠心臟組織的亞克隆細胞系，由于來源于心臟，常作為心臟成肌細胞用于心肌疾病的研究。將H9C2細胞置于含有10% FBS 100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素的 DMEM培養液中，37 ℃ 5% CO2細胞孵箱培養，培養液每 2天換1次[10]。

1.2.2建模和分組

將正常培養的 H9C2細胞分成4組。對照組(Con組)：37 ℃ 5% CO2培養箱中正常培養；缺氧/復氧模型組(H/R組)：在37 ℃ 5%CO2培養箱中培養24 h后換液，細胞長至80%后將細胞用PBS沖洗，加入不含血清的低糖DMEM，置入85%N2、10%H2、5%CO2的37%飽和濕度厭氧培養箱，分別缺氧培養6 h，加入新鮮DMEM培養基，置于5% CO2培養箱中繼續復氧培養12 h[11]；抗氧化劑NAC組(NAC組)：僅在培養基中加入終濃度為1 mmol/L抗氧化劑NAC，不進行缺氧/復氧處理[12]；抗氧化劑+模型組(NAC+H/R組)：缺氧/復氧前1 h在培養基中加入終濃度為1 mmol/L抗氧化劑NAC預處理，再進行缺氧/復氧處理。

1.2.3Western blot檢測細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2表達

取各組處理后的H9C2細胞，以預冷的 PBS洗滌 3次后加入100 μL含10% PMSF和5%磷酸酶抑制劑的細胞裂解液(使用前5 min 配置)，低溫離心取蛋白上清液后進行蛋白定量；上樣后進行SDS-PAGE 凝膠電泳，電泳完成后再用200 mA恒定電流進行0.22 μm PVDF轉膜90 min，封閉2 h，繼續孵一抗過夜，TBST緩沖液清洗 3次，室溫下孵二抗1 h，TBST清洗3次，化學發光儀進行檢測。Image J軟件分析照片中蛋白條帶的吸光度(A)值，計算目的蛋白相對表達水平。

1.2.4細胞免疫熒光檢測ROS水平、DNA損傷、細胞損傷情況[13]

H9C2細胞接種于6孔培養板的細胞爬片上。各組處理后，PBS漂洗2次,10 mmol/L的DCFH-DA染液于37 ℃孵育30 min，DAPI 37 ℃復染細胞核10 min。隨機選取5個視野用熒光顯微鏡采集照片。

經過分組處理后，PBS清洗細胞爬片3次，4%的多聚甲醛的固定10 min，放入含0.1% Triton X-100的PBS中室溫孵育15 min。PBS清洗3次，分別加入目的抗體4 ℃過夜；次日PBS清洗3次，分別采用對應熒光二抗室溫孵育1 h，PBS 清洗3次，加入1 μg/mL DAPI 37 ℃復染細胞核10 min；加抗淬滅封片劑蓋上蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。Image J軟件分析各樣品的平均熒光強度。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 各組細胞氧化應激ROS水平

與Con組比較，H/R組細胞內ROS水平升高(P<0.05)；與H/R組比較，NAC+H/R組ROS水平明顯降低(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組細胞ROS水平

2.2 各組DNA損傷、細胞損傷情況

與Con組比較，H/R組細胞p-γH2ax、8-OHdG、Cytochrome c表達增多(P<0.05)；與H/R組比較，NAC+H/R組細胞p-γH2ax、8-OHdG、Cytochrome c表達明顯降低(P<0.05)，見圖2、3。

A:各組熒光顯示圖；B:p-γH2ax；C：8-OHdG。

圖3 各組細胞損傷情況

2.3 各組細胞凋亡情況

與Con組比較，H/R組細胞Bax/Bcl-2表達增加(P<0.05)；與H/R組比較，NAC+H/R組細胞Bax/Bcl-2表達減少(P<0.05)，見圖4。

A:Western blot；B:Bax/Bcl-2。

3 討 論

MIRI是多種因素共同作用的結果，當發生心肌缺血再灌注時，ROS通過心肌細胞和內皮細胞的一系列相互作用途徑暴發性產生[14]，并成為缺血后損傷的關鍵機制。當心肌發生缺血或梗死時，細胞內氧自由基的形成增加，同時抗氧化系統受到限制，O2-和H2O2的清除減少，使氧自由基轉變成最強的-HO，超過了機體捕獲清除的能力[15]。ROS可攻擊生物膜上的不飽和脂肪酸發生脂質過氧化，破壞心肌細胞膜結構完整性，最終造成MIRI。另外，氧化應激可通過上調細胞凋亡相關蛋白Bax/Bcl-2來引發細胞損傷。可見氧化應激在心肌細胞凋亡和損傷過程中起著至關重要的作用，它們參與了MIRI的發病機制。因此，ROS的產生是決定心肌損傷嚴重程度的重要因素。

DNA 作為生物體最重要的遺傳物質，對正常情況下不可再生的心肌細胞來講尤為重要[15]。相關研究表明：氧化應激是導致細胞DNA損傷的重要因素之一[16]。MIRI過程中ROS產生過多或 DNA損傷未能修復，將對心肌造成不可逆的損傷[17]。此外，既往研究發現，當機體發生DNA損傷后會激活細胞周期“防火墻”，可暫時阻滯細胞周期的進展，而且還會激活相關的修復通路對損傷的DNA進行修復，如果DNA損傷無法完全被修復，則會引起細胞凋亡甚至壞死[18]。本研究顯示，大鼠心肌細胞經過缺氧/復氧處理后，細胞內ROS水平升高，DNA損傷明顯加重，凋亡增多。而之前的研究也有類似報道，MIRI病理過程中氧化應激產生的ROS很可能導致心肌細胞的DNA 損傷[19]。

因此，尋找一個心臟保護劑和抗氧化劑來調節ROS水平進行預處理，對改善心臟功能和延緩心肌壞死具有重要的臨床意義[4,6]。最近，基礎研究提供了心肌缺血和再灌注期間ROS形成的直接證據，一些臨床前和臨床研究也已經證明抗氧化劑的潛在心臟保護價值[20-22]。NAC作為一種含有巰基的抗氧化劑，它能干擾ROS、清除自由基。有研究報道NAC可通過減少自由基的產生，拮抗 ROS介導的大鼠 H9C2心肌細胞凋亡[23]，與本研究結果一致。臨床上，NAC是極具研究價值且用途廣泛的藥物，其在治療慢性肝損害、呼吸系統疾病、神經退行性疾病、艾滋病和心功能損傷等疾病方面均取得了較好的療效。然而，NAC是一種非特異性的抗氧化劑，它不能針對性地降低具有破壞性的氧化因素，甚至可能干預到正常的生理水平的氧化功能。筆者加入終濃度為1 mmol/L抗氧化劑NAC，結果顯示NAC組與Con組細胞內ROS水平、DNA損傷均無明顯差異。如果明確加重MIRI過程中氧化應激的種類，進行有針對地干預清除而保留生理功能的氧化水平將會極大地發揮該類抗氧化劑的治療效果[4]，后續研究將以此為側重點。

綜上所述,氧化應激介導的DNA損傷可能密切參與MIRI的發病過程，抗氧化劑NAC可明顯減少氧化應激心肌細胞的DNA損傷和凋亡，從而減輕MIRI。