二甲雙胍對骨骼肌異位脂肪沉積的作用機制研究

鄭 暉，全軍承，程 績，周人杰

(陸軍軍醫大學第二附屬醫院急診科，重慶 400037)

骨骼肌異位脂肪沉積是機體發生糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗和2型糖尿病的重要原因[1-2]。圍脂滴蛋白(perilipin，PLIN)是最具代表性的脂滴包被蛋白，它直接或間接參與骨骼肌的脂質代謝，與脂滴的動態平衡、脂質代謝穩態及靶器官胰島素敏感性關系密切[3-5]。有研究證實，PLINs的表達受腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)[6]和過氧化物酶體增殖物激活受體δ(PPARδ)信號通路的調控[7]。二甲雙胍是臨床上防控糖尿病的一線藥物，它能激活AMPK信號通路，增強骨骼肌的胰島素敏感性。因此，本研究旨在探討二甲雙胍是否通過AMPK-PPARδ-PLINs信號通路抑制骨骼肌異位脂肪沉積，從而改善胰島素抵抗。

1 材料與方法

1.1 材料

8周齡C57BL/6J小鼠24只由陸軍軍醫大學實驗動物中心提供，分籠飼養在SPF級動物房，自由飲水覓食、恒溫。標準飼料和60%高脂飼料購自北京華阜康生物科技有限公司。二甲雙胍購自美國Sigma公司；歐姆龍血糖儀、配套血糖試紙，以及胰島素(INS)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和游離脂肪酸(FFA)檢測試劑盒購自上海酶聯生物有限公司；一抗PLIN2和PLIN5購自英國Abcam公司，一抗AMPK、PPARδ、p-AMPK購自美國Cell Signaling公司；DNA提取試劑盒購自凱杰公司；PCR和逆轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司。PLIN1:上游引物TGGAAACTGAGGAGAACAAG，下游引物ATGTCACAGCCGAGATGG;PLIN2:上游引物GAAACTGAGGAGAACACATCA，下游引物TGTCACGACATCAGCCA;PLIN3:上游引物TATTGGATCCGTACAGCCCAG，下游引物TATTAAGCTTGCCCCACGAC;PLIN4:上游引物TAACCCTATTATCTCTCCCT，下游引物GGTGTTTTAGGATTGACAT;PLIN5：上游引物GGTGACATCAGCCAAGGATACAG，下游引物TCCACCAGCTTCTCCGACTT;18s RNA:上游引物CGCAAATTACCCACTCCCGAC，下游引物GTAACCTCCCGTTCAGACCAC。

1.2 方法

1.2.1實驗分組

本研究經陸軍軍醫大學第二附屬醫院倫理委員會審查批準實驗。將小鼠分為對照組(ND組)、高脂組(HF組)、高脂+二甲雙胍組(HF+Met組)，每組8只。ND組喂養標準飼料，HF和HF+Met組喂養高脂飼料。二甲雙胍溶于水中，每日按照250 mg/kg的計量給予HF+Met組小鼠灌胃。每周稱重1次，持續喂養16周，空腹隔夜后剪鼠尾取血檢測血糖。乙醚麻醉心臟取血，頸椎脫臼處死小鼠，取材做如下實驗。

1.2.2ELISA檢測血清脂代謝相關生化指標水平

心臟取血，靜置2 h后3 000 r/min離心10 min,吸取上層血清分裝入新的EP管中，按照INS、TG、TC、LDL-C、HDL-C和FFA檢測試劑盒說明書檢測其水平。

1.2.3骨骼肌油紅O染色

比目魚肌切成1 cm×1 cm的方塊于OCT包埋劑中，放入液氮中急凍20 s，冰凍切片成16 μm厚切片，在4%多聚甲醛溶液中固定10 min，清水沖洗載玻片。將載玻片浸泡在60%異丙醇中30 s，在油紅O溶液中室溫孵育15 min。60%異丙醇洗2次，清水洗2 min，蘇木精復染30 s后用水清洗過量的蘇木精。索尼數碼相機光鏡400倍，取油紅O染色比目魚肌照片。

1.2.4骨骼肌內TG水平測定

取比目魚肌組織50 mg，加入200 μL的PBS，組織勻漿機盡量破碎組織，4 ℃ 3 000 r/min離心15 min。提取上清液按照試劑盒說明書檢測。

1.2.5PCR檢測PLINs mRNA表達

提取比目魚肌組織RNA，取1 μL檢測RNA的濃度和純度，檢測PLINs mRNA表達，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.2.6Western blot檢測AMPK、PPARδ、p-AMPK、PLIN2和PLIN5表達

取比目魚肌組織20 mg，加入蛋白裂解液300 μL，冰上勻漿裂解30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心20 min,提取上層清液測定蛋白濃度，煮沸10 min變性蛋白。上樣、電泳、轉膜結束后，放入10%脫脂牛奶中封閉2 h，加入AMPK、PPARδ、p-AMPK、PLIN2和PLIN5一抗過夜。加入相應二抗，曝光后Image J進行灰度值分析。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 各組血清糖、脂代謝相關生化指標比較

與ND組比較，HF組中小鼠體重、血清中糖代謝相關生化指標[空腹血糖(FBG)與空腹血胰島素(FINS)]及脂代謝相關生化指標(TG、TC、LDL-C和FFA)水平明顯升高(P<0.05)，二甲雙胍干預后，體重、FBG、 FINS、TG、TC和FFA等指標較HF組明顯降低(P<0.05)，見表1。

表1 各組糖、脂代謝相關生化指標比較

2.2 各組骨骼肌脂滴(LD)和TG水平比較

HF組中紅色LD的數量明顯增多(P<0.05)，TG水平明顯升高(P<0.05)，二甲雙胍干預后LD和TG水平明顯降低(P<0.05)，見圖1。

A：油紅O染色(×400)；B：TG水平；*：P<0.05,與ND組比較;#：P<0.05,與HF組比較。

2.3 各組PLINs表達比較

PLIN1在比目魚肌組織不表達；各組PLIN3、PLIN4 mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)；HF組中PLIN2、PLIN5 mRNA和蛋白表達明顯高于ND組(P<0.05)；二甲雙胍干預后，PLIN2 mRNA和蛋白表達明顯降低(P<0.05)，而PLIN5表達未見明顯變化(P>0.05)，見圖2、3。

*：P<0.05,與ND組比較;#：P<0.05,與HF組比較。

2.4 各組AMPK、PPARδ蛋白表達比較

與ND組比較，HF組p-AMPK、PPARδ蛋白表達明顯降低(P<0.05)，二甲雙胍干預后，p-AMPK和PPARδ蛋白表達明顯升高(P<0.05)，見圖3。

*：P<0.05,與ND組比較;#：P<0.05,與HF組比較。

3 討 論

肥胖已成為全球性的重大公共衛生問題，我國肥胖形勢不容樂觀，平均肥胖率高達12%，并且呈現出年輕化趨勢[8]。肥胖一方面將過剩的能量以TG的形式儲存于脂肪組織中，另一方面過多的FFA進入到其他非脂肪組織中，引起異位脂肪沉積，其中骨骼肌異位脂肪沉積在胰島素抵抗的發生、發展中起著至關重要的作用[1-2]。因此，如何有效地防止骨骼肌異位脂肪沉積已成為防治胰島素抵抗，甚至2型糖尿病的重點。本文通過高脂誘導建立小鼠肥胖模型，發現二甲雙胍逆轉了在高脂誘導下小鼠糖、脂代謝異常，骨骼肌中LD增多，TG水平和PLIN2 mRNA、蛋白表達升高，p-AMPK、PPARδ蛋白表達降低。高脂誘導下PLIN5 mRNA和蛋白表達明顯升高，而二甲雙胍干預后它的表達水平有所下降，但無明顯變化。

PLINs是典型的脂滴包被蛋白，家族中5個亞型都不同程度地參與LD的合成、生長、轉運及降解。但是5個亞型的表達具有組織特異性。PLIN1主要表達在脂肪和類固醇細胞中，在骨骼肌中不表達[9]。PLIN2在脂肪細胞和骨骼肌細胞中高表達，它的表達量與骨骼肌中LD呈明顯的正相關，并且能與脂肪分解的限速酶相互作用[10]。研究表明脛骨前肌過表達PLIN2增加了肌肉中TG水平及LD的大小、數量，在培養的肌管細胞中PLIN2的下調阻止了油酸誘導的LD儲存，這些證據推測PLIN2可能參與了LD的合成和生長[11]。本研究發現，在高脂模型的比目魚肌組織中的TG水平、LD數量、PLIN2 mRNA和蛋白表達明顯升高，二甲雙胍干預后PLIN2表達隨著TG水平和LD數量減少而降低。但是值得思考的是，到底是由于LD的變化導致PLIN2變化還是由于PLIN2變化引起LD變化，二者的因果關系還需今后進一步的實驗研究。本研究發現，PLIN3在骨骼肌中表達，但是在高脂模型和高脂+二甲雙胍干預模型下PLIN3表達水平并無明顯變化。而之前有證據顯示，在AMPK的激動劑作用下，股四頭肌中PLIN3表達水平明顯升高[12]。二甲雙胍作為AMPK的激活劑，在本研究中并未表現出刺激PLIN3的作用，這可能與實驗的肌肉取材相關，比目魚肌主要是以慢肌纖維為主，而股四頭肌是混合型肌纖維，肌纖維類型的差別導致了PLIN3表達的差異性。

PLIN5主要在肝臟、脂肪、心臟和骨骼肌等氧化代謝高的組織中[13]。BOSMA等[14]發現骨骼肌中過表達PLIN5導致了肌內TG水平升高，推測其可能作為脂質屏障，保護LD不受脂肪酶水解活性的影響。本研究同樣發現在高脂模型下，骨骼肌內TG和LD升高，PLIN5 mRNA和蛋白表達也明顯升高。二甲雙胍干預后，肌內TG和LD降低，但是PLIN5表達并無明顯變化。前期研究顯示，PLIN5不僅定植于LD表面，還定位在細胞質和線粒體中，并且它的轉錄活性受PPARδ調控。BINDESB?LL等[15]發現PLIN5的基因結構域中存在PPAR功能性結合位點，并且證實PLIN5可作為PPARδ在肌肉組織中的直接作用靶點，長鏈脂肪酸誘導PLIN5轉錄活性增加依賴PPARδ的表達。LAURENS等[13]推測，在骨骼肌氧化代謝需求增強時，PLIN5作為LD和線粒體之間溝通的橋梁，促進脂肪酸轉運入線粒體，增強脂肪分解代謝。因此，筆者認為在高脂誘導下，LD表面的PLIN5表達升高協同PLIN2促進過多的FFA以TG的形式儲存在肌細胞中，而二甲雙胍作為AMPK激活劑，當氧化代謝增強時，細胞質和線粒體PLIN5表達升高促進脂肪酸有氧氧化。本課題組后續將針對PLIN5的定位變化深入研究。

綜上所述，二甲雙胍可能通過AMPK-PPARδ信號通路調控PLIN2、5表達和定位，抑制骨骼肌中LD生成和TG水平，進而改善胰島素抵抗。