蒙藥掃日勞-4味湯對特發性肺纖維化模型大鼠的改善作用及機制初探

白萬富 劉玉鍵 李想 王朋 常虹 郝海梅 白迎春 劉全禮 石松利

摘 要 目的：初步探討蒙藥掃日勞-4味湯對特發性肺纖維化模型大鼠的改善作用及機制。方法：將雄性SD大鼠隨機分為正常對照組、模型組、陽性對照組（吡非尼酮，0.163 g/kg）和掃日勞-4味湯低、中、高劑量組（0.899、1.798、3.596 g/kg），每組8只。除正常對照組外，其余各組大鼠均按5 mg/kg于氣管內緩慢注射6 mg/mL博來霉素1次以復制特發性肺纖維化模型。從建模后的第1天起，正常對照組和模型組大鼠灌胃生理鹽水，其余各組大鼠灌胃相應藥液，每天1次，給藥體積均為10 mL/kg，連續給藥4周。實驗期間，觀察各組大鼠的一般情況并稱定其體質量。末次給藥24 h后，觀察各組大鼠肺的外觀形態，采用蘇木精-伊紅和Masson染色觀察肺組織形態學特征，采用酶聯免疫吸附法測定其血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量，肺組織中羥脯氨酸（HYP）、白細胞介素1β（IL-1β）、IL-6、透明質酸酶（HA）、層粘連蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原（PC-Ⅲ）、Ⅳ型膠原（Col-Ⅳ）含量，采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應技術測定其肺組織中轉化生成因子β1（TGF-β1）、Smad3、Smad7 mRNA的表達水平。結果：與模型組比較，掃日勞-4味湯各劑量組和陽性對照組大鼠活動、毛發、飲食等均有明顯改善，末次給藥后的體質量均顯著升高，肺組織病理改變和肺纖維化特征均明顯改善，血清中SOD活性顯著升高，血清中MDA含量（掃日勞-4味湯中劑量組除外）和肺組織中HYP（掃日勞-4味湯高劑量組除外）、IL-1β、IL-6、HA、LN、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ（掃日勞-4味湯高劑量組除外）含量以及TGF-β1、Smad3 mRNA的表達水平均顯著降低，Smad7 mRNA的表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。結論：掃日勞-4味湯可以顯著改善特發性肺纖維化模型大鼠肺部病理改變，延緩并逆轉肺纖維化進展，其機制可能與抑制炎癥反應，改善脂質過氧化，下調TGF-β1、Smad3 mRNA表達，上調Smad7 mRNA表達有關。

關鍵詞 特發性肺纖維化;蒙藥;掃日勞-4味湯;炎癥因子;氧化應激;轉化生長因子β1/Smad信號通路;大鼠

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To preliminarily investigate the improvement effects and mechanism of Mongolian medicine Saorilao-4 decoction on specific pulmonary fibrosis model rats. METHODS： Male SD rats were randomly divided into normal control group， model group， positive control group （pirfenidone， 0.163 g/kg） and Saorilao-4 decoction low， medium and high dose groups （0.899， 1.798， 3.596 g/kg）， 8 rats in each group. Except for normal control group， other groups were given 6 mg/mL bleomycin intratracheally at 5 mg/kg once to induce the specific pulmonary fibrosis model. From the first day after modeling， normal control group and model group were given normal saline intragastrically， other groups were given corresponding drugs intragastrically， once a day， 10 mL/kg， for 4 weeks. During the experimental period， the general condition of the rats in each group was observed and the body mass was weighed. Twenty-four h after last medication， the appearance morphology of rat lung in each group were observed. The morphological characteristics of lung tissues were observed by HE and Masson staining. ELISA was adopted to determine the activity of SOD and the content of MDA in serum， the contents of hydroxyproline （HYP）， IL-1β， IL-6， hyaluronidase （HA）， laminin （LN）， precollagen type Ⅲ （PC-Ⅲ） and collagen type Ⅳ （Col-Ⅳ） in lung tissue. RT-PCR was used to determine the mRNA expression of TGF-β1， Smad3 and Smad7 in lung tissue. RESULTS： Compared with model group， the activity， hair and diet of the rats in each dose group of Saorilao-4 decoction and positive control group were significantly improved， and the body mass after the last administration was significantly increased; the pathological change of lung and pulmonary fibrosis were significantly improved， and the activity of SOD in serum was increased significantly. Serum content of MDA （except for Saorilao-4 decoction medium dose group）， the contents of HYP （except for Saorilao-4 decoction high dose group）， IL-1β， IL-6， HA， LN， PC-Ⅲ， Col-Ⅳ （except for Saorilao-4 decoction high dose group） as well as mRNA expression of TGF-β1 and Smad3 in lung tissue were significantly decreased; mRNA expression of Smad7 was significantly increased （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Saorilao-4 decoction can significantly improve the lung pathological changes， delay and reverse the progression of pulmonary fibrosis in specific pulmonary fibrosis model rats， the mechanism of which may be related to the inhibition of inflammatory response， improvement of lipid peroxidation， down-regulation of TGF-β1 and Smad3 mRNA expression， and up-regulation of Smad7 mRNA expression.

KEYWORDS ? Specific pulmonary fibrosis; Mongolian medicine; Saorilao-4 decoction; Inflammatory factors; Oxidative stress;TGF-β1/Smad signaling pathway; Rats

特發性肺纖維化是一組病因不明且以肺間質彌散性滲出、浸潤和纖維化為主要病變的疾病，醫學上將其歸屬為肺間質疾病，主要癥狀為進行性呼吸困難、氣短、干咳、喘憋，最終可導致患者呼吸衰竭，甚至造成死亡，病死率達50%～70%，是許多肺部疾病發展、演變、疤痕化的最終結局[1-2]。已有研究表明，肺纖維化患者預后很差，大部分被確診的特發性肺纖維化患者的平均生存期僅有3～5年，5年生存率僅為20%[3-4]。但目前，臨床治療肺纖維化的方法和藥物十分有限，故研究與開發治療肺纖維化的有效藥物就顯得尤為重要。

蒙藥掃日勞-4味湯出自《醫法海鑒》，別名有四味沙參湯、查干掃日老-4湯等，是由北沙參（別名查干-掃日勞、查干蘇如老）、甘草、拳參、紫草茸等藥材經混合、研磨制成的湯劑[5]。該方具有清熱、止咳作用，主治肺熱、氣喘、咳嗽、痰成黃色或帶血、血熱引起的肺部作痛、感冒等癥[6]。掃日勞-4味湯方中，以味甘苦、性涼柔而有清肺熱、止咳作用的北沙參為主，以清血熱及肺熱的紫草茸為輔，佐以甘草以止咳祛痰，拳參以清肺熱、解毒，故本方為治療肺熱病及各種熱型咳嗽的常用方[7]。

據文獻報道，轉化生長因子β1（TGF-β1）/Smad信號通路參與了特發性肺纖維化的發生發展。TGF-β1在纖維化的肺組織中表達增加，并能影響細胞外基質沉積[8]。Smad蛋白家族是TGF-β1的下游底物分子[9]。在纖維化發展過程中，膠原蛋白沉積需依賴于Smad3，故Smad3被認為是各種促纖維化信號的最終整合因子[9]。Smad7可調節肺損傷修復過程中TGF-β1的異常表達，從而抑制肺纖維化進程[10]。本課題組前期對多種治療呼吸系統疾病的蒙藥現用方劑進行篩選后發現，掃日勞-4味湯具有抑制肺纖維化的作用。在此基礎上，本文擬利用特發性肺纖維化大鼠模型，探討掃日勞-4味湯對模型大鼠肺纖維化、炎癥因子、抗氧化相關指標的影響，并結合肺組織形態學特征和分子生物學方法，研究該方抗特發性肺纖維化的藥效學特征及對相關基因表達的影響，以期為深入研究掃日勞-4味湯對特發性肺纖維化的改善作用及其具體機制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本文所用主要儀器包括7500型熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國AB公司）、Vlultifuge X1R型臺式高速冷凍離心機和Nanodrop2000型微量分光光度儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）、CX31型光學顯微鏡和AU640型全自動生化分析儀（日本Olympus公司）、BSA124S-CW型電子天平（德國Sartorius公司）、K4896-B型快速混勻器（姜堰市新康醫療器械有限公司）、DZW-型水浴鍋（北京市永光明醫療儀器廠）、TGL-16M型冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）、Multiskan GO型酶標儀[賽默飛世爾科技（中國）有限責任公司]、TDZ4-WS型低速自動平衡離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）、MS-700型研磨機（寧波美善美心電器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

掃日勞-4味湯（批號20200414，規格每袋3 g，北沙參-甘草-拳參-紫草茸的質量比5 ∶ 3 ∶ 3 ∶ 3）購自內蒙古國際蒙醫醫院國家蒙藥制劑中心;吡非尼酮膠囊（陽性藥物，批號20200711，規格100 mg）購自北京康蒂尼藥業有限公司;注射用博來霉素（批號SL30191404，規格100 mg/mL）購自北京酷來搏科技有限公司;蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（批號20191231）購自北京百奧萊博科技有限公司;Masson染液（批號20191025）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號20201104）、丙二醛（MDA）試劑盒（批號20201105）、羥脯氨酸（HYP）試劑盒（批號20201029）、總蛋白定量測定試劑盒（批號20201029）、白細胞介素1β（IL-1β）試劑盒（批號CK-E30206）、IL-6試劑盒（批號CK-E30219）、透明質酸酶（HA）試劑盒（批號CK-E30811）、層粘連蛋白（LN）試劑盒（批號CK-E30254）、Ⅲ型前膠原（PC-Ⅲ）試劑盒（批號CK-E31310）、Ⅳ型膠原（Col-Ⅳ）試劑盒（批號CK-E34380）均購自南京建成生物工程研究所;Trizol試劑盒（批號U8926）購自天根生化科技（北京）有限公司;熒光定量PCR試劑盒（批號30537）購自康為世紀生物科技有限公司;氯化鈉注射液（批號2012056G，規格200 mL，1.8 g，作生理鹽水用）購自山東華魯制藥有限公司;其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動物

健康成年雄性SPF級SD大鼠48只，體質量180～250 g，由中國食品藥品檢定研究院提供，動物生產許可證號為SCXK（京）2017-0005。飼養環境通風狀況良好，室溫為22～27 ℃，相對濕度為（50±5）%。所有大鼠均自由攝食、飲水。

2 方法

2.1 分組與造模

將大鼠隨機分為正常對照組、模型組、陽性對照組（吡非尼酮，0.163 g/kg，根據說明書規定劑量并按體表面積[11]換算所得）和掃日勞-4味湯低、中、高劑量組（0.899、1.798、3.596 g/kg，根據說明書規定劑量并按體表面積[11]換算得中劑量，低、高劑量分別為中劑量的0.5和2倍），每組8只。除正常對照組外，其余各組大鼠均按5 mg/kg于氣管內緩慢注射6 mg/mL博來霉素1次以復制特發性肺纖維化模型[12-14]。若大鼠肺組織受損面積大于50%則表示特發性肺纖維化模型成功[15]。

2.2 給藥

從建模后的第1天開始，正常對照組和模型組大鼠分別灌胃等體積生理鹽水，各藥物組大鼠分別灌胃相應劑量的藥液（均以生理鹽水為溶劑），每天1次，給藥體積均為10 mL/kg，連續給藥4周。

2.3 大鼠一般情況觀察

觀察實驗過程中各組大鼠的活動、毛發、飲食、體質量等一般情況。

2.4 大鼠肺的外觀形態觀察與樣品采集

于末次給藥24 h后處死各組大鼠，立即觀察其雙肺的顏色、質地、形態、體積等外觀變化;然后于腹主動脈取血5 mL，分離血清或血漿并于-80 ℃下冷藏，備用;取左肺下葉組織適量，用4%多聚甲醛溶液固定，備用;取右肺組織適量，經液氮速凍后于-80 ℃下冷藏，備用。

2.5 大鼠肺組織形態學變化觀察

取各組大鼠經固定的左肺下葉組織，制成病理切片并進行HE、Masson染色[16-17]。將染色后的切片置于光學顯微鏡下觀察肺組織形態學變化，記錄結果并進行病理評分。根據病變程度分別賦分：0分，HE染色結果顯示（下同）受損面積為0;1分，受損面積小于25%;2分，受損面積為26%～50%;3分，受損面積為51%～75%;4分，受損面積大于75%[15]。

2.6 大鼠氧化和纖維化相關指標測定

取各組大鼠血清和右肺組織適量，采用酶聯免疫吸附測定法（ELISA）以酶標儀測定血清中SOD活性、MDA含量和肺組織中HYP含量，根據相應試劑盒說明書進行操作。

2.7 大鼠肺組織中炎癥因子和纖維化相關指標測定

取各組大鼠右肺組織適量，采用ELISA法以酶標儀測定肺組織中炎癥因子IL-1β、IL-6和纖維化相關指標HA、LN、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ含量，根據相應試劑盒說明書進行操作。

2.8 大鼠肺組織中TGF-β1/Smad信號通路關鍵基因表達測定

采用實時熒光定量PCR法進行測定。取各組大鼠右肺組織適量，采用Trizol法提取總RNA，以微量分光光度儀測定RNA的濃度后，將其反轉錄合成cDNA。按熒光定量PCR試劑盒說明書方法配制反應體系，PCR反應體系（50 μL）包含2×Real SYBR Mixture 25 μL，10 ?mol/L上、下游引物各1 μL，cDNA模板 2 μL，ddH2O加至50 μL。按如下反應條件進行PCR擴增：95 ℃預變性10 min;95 ℃變性15 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸20 s，72 ℃再延伸2 min，共35個循環。根據GenBank數據庫（http：//ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）報道的TGF-β1、Smad3和Smad7的引物序列，應用DNASTAR 12.1軟件設計并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列與產物長度詳見表1。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算TGF-β1、Smad3和Smad7 mRNA的表達水平。

2.9 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析。實驗數據以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠的一般情況

正常對照組大鼠攝食飲水正常，能夠正常行動，雙眼有神，皮毛柔順。模型組大鼠攝食飲水日漸減少，行動遲緩，目光呆滯，皮毛粗糙、脫落嚴重，行為懶散，身體機能有明顯下降，主要表現為肢體協調性差、動作不靈敏。與模型組比較，掃日勞-4味湯各劑量組和陽性對照組大鼠的上述癥狀和表現均明顯好轉。

與正常對照組比較，模型組大鼠末次給藥后的體質量顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，掃日勞-4味湯各劑量組和陽性對照組大鼠末次給藥后的體質量均顯著升高（P<0.01），詳見表2。

3.2 大鼠肺的外觀形態變化

正常對照組大鼠肺鮮紅，質地均一柔軟。模型組大鼠肺成棕褐色且腫脹，纖維化嚴重，質地偏硬，有斑點，色澤不均勻。掃日勞-4味湯各劑量組和陽性對照組大鼠肺顏色和質地均有明顯改善，其中陽性對照組和掃日勞-4味湯低劑量組改善較明顯，詳見圖1。

3.3 大鼠肺組織的形態學變化

HE染色結果顯示，正常對照組大鼠肺泡結構正常，肺泡壁上皮細胞形態及數量正常，肺泡間隔正常未見增厚，肺間質無明顯炎癥細胞浸潤。與正常對照組比較，模型組大鼠肺泡結構破壞，部分肺泡壁塌陷、融合，肺泡壁上皮細胞形態破壞、不規則、數量明顯減少，肺泡間隔明顯增厚，肺間質可見增生及大量炎癥細胞浸潤，其病理評分顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，掃日勞-4味湯各劑量組和陽性對照組大鼠肺泡結構、肺泡壁上皮細胞形態、數量及肺間質炎癥程度均明顯改善，其病理評分均顯著降低（P<0.01），其中掃日勞-4味湯低劑量組大鼠的病理評分顯著低于掃日勞-4味湯中、高劑量組（P<0.05），詳見圖2、表3。

Masson染色結果顯示，正常對照組大鼠肺泡結構正常，肺泡間隔未見增厚，肺間質無明顯藍紫色膠原纖維沉積。與正常對照組比較，模型組大鼠肺泡結構破壞，肺泡間隔明顯增厚，肺間質可見大量片狀藍紫色膠原纖維沉積。與模型組比較，掃日勞-4味湯各劑量組和陽性對照組大鼠肺泡結構、肺泡間隔、肺間質炎癥程度及膠原纖維沉積程度均明顯改善，其中掃日勞-4味湯低劑量組和陽性對照組大鼠肺間質膠原沉積改善較明顯，詳見圖3。

3.4 大鼠氧化和纖維化相關指標活性/含量變化

與正常對照組比較，模型組大鼠血清中SOD活性顯著降低，血清中MDA含量和肺組織中HYP含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，掃日勞-4味湯各劑量組和陽性對照組大鼠血清中SOD活性顯著升高，血清中MDA含量（掃日勞-4味湯中劑量組除外）和肺組織中HYP含量（掃日勞-4味湯高劑量組除外）均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表4。

3.5 大鼠肺組織中炎癥因子和纖維化相關指標含量變化

與正常對照組比較，模型組大鼠肺組織中IL-1β、IL-6、HA、LN、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ含量均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，掃日勞-4味湯各劑量組和陽性對照組大鼠肺組織中IL-1β、IL-6、HA、LN、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ（掃日勞-4味湯高劑量組除外）含量均顯著降低（P<0.01），詳見表5。

3.6 大鼠肺組織中TGF-β1/Smad信號通路相關基因表達水平變化

與正常對照組比較，模型組大鼠肺組織中TGF-β1、Smad3 mRNA的表達水平均顯著升高，Smad7 mRNA的表達水平顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，掃日勞-4味湯各劑量組和陽性對照組大鼠肺組織中TGF-β1、Smad3 mRNA的表達水平均顯著降低，Smad7 mRNA的表達水平均顯著升高（P<0.01），詳見表6。

4 討論

本研究制備特發性肺纖維化模型采用的是目前經典的博來霉素誘導法。該法利用抗腫瘤藥博來霉素來引發肺纖維化，具有給藥劑量小、模型死亡率低等特點[12-14]。

目前，肺纖維化的治療方法和藥物十分有限，尋找和開發治療肺纖維化的有效方法和藥物已成為醫學科研界的研究熱點之一。蒙藥掃日勞-4味湯主要由北沙參、拳參、甘草和紫草茸組成，臨床主要用于治療肺熱咳嗽等癥[18-19]。吡非尼酮是一種新的具有廣譜抗纖維化作用的吡啶酮類藥物，能夠防止和逆轉纖維化和瘢痕的形成[20]，故本研究選用該藥作為陽性對照藥。肺組織的形態學變化結果顯示，掃日勞-4味湯和吡非尼酮均可逆轉模型大鼠的肺纖維化進展。

本研究測定了與肺纖維化發生發展相關的多項生化指標，其中SOD作為生物體抗氧化系統中很重要的一種酶，其可抑制自由基啟動的脂質過氧化[21];MDA的含量可以反映機體脂質過氧化的程度[22];HYP的含量可間接反映肺組織中膠原纖維含量的變化[23]。本研究結果顯示，模型組大鼠血清中SOD活性顯著低于正常對照組，血清中MDA和肺組織中HYP含量均顯著高于正常對照組，同時模型組大鼠肺組織中炎癥細胞浸潤、膠原纖維沉積明顯，說明博來霉素誘導的特發性肺纖維化模型建立成功。與模型組比較，掃日勞-4味湯各劑量組和陽性對照組大鼠血清中SOD活性顯著升高，血清中MDA含量（掃日勞-4味湯中劑量組除外）和肺組織中HYP含量（掃日勞-4味湯高劑量組除外）均顯著降低，說明掃日勞-4味湯和吡非尼酮均可抑制和清除模型大鼠肺組織中的自由基，改善脂質過氧化，從而減輕肺組織損傷。

已有研究表明，IL-1β、IL-6可以聚集炎癥因子，降低基質金屬蛋白酶抑制劑1的活性并抑制其合成[24]。HA是纖維化中變化最快、振幅較大的指標，其含量若持續升高則提示纖維化未得到控制[25]。LN為基底膜中特有的非膠原性結構蛋白，與纖維化活動程度成正相關[26]。PC-Ⅲ和Col-Ⅳ在細胞內合成后直接以前膠原的形式參與細胞外間質的合成，與纖維化程度成正相關[27]。本研究結果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠肺組織中IL-1β、IL-6、HA、LN、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ含量均顯著升高。與模型組比較，掃日勞-4味湯各劑量組和陽性對照組大鼠肺組織中IL-1β、IL-6、HA、LN、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ（掃日勞-4味湯高劑量組除外）含量均顯著降低，說明掃日勞-4味湯和吡非尼酮均可減輕模型大鼠的炎癥反應，改善其肺纖維化程度。

在肺纖維化形成過程中，除氧化應激、炎癥反應外，TGF-β1/Smad信號通路已被證實具有重要作用[8-10，28-29]。TGF-β1可通過激活Smad蛋白促使成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化;Smad7可負調控TGF-β1，具有抑制TGF-β1/Smad信號轉導的作用;細胞內磷酸化Smad2/3（p-Smad2/3）的表達量與Smad通路的激活程度成正相關[30-32]。本研究結果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠肺組織中TGF-β1、Smad3 mRNA的表達水平均顯著升高，Smad7 mRNA的表達水平顯著降低。與模型組比較，掃日勞-4味湯各劑量組和陽性對照組大鼠肺組織中TGF-β1、Smad3 mRNA的表達水平均顯著降低，Smad7 mRNA的表達水平均顯著升高，說明掃日勞-4味湯和吡非尼酮均可下調模型大鼠肺組織中TGF-β1、Smad3 mRNA的表達水平，上調Smad7 mRNA的表達水平。

綜上所述，掃日勞-4味湯可以顯著改善特發性肺纖維化模型大鼠肺部病理改變，延緩并逆轉肺纖維化進展，其機制可能與抑制炎癥反應，改善脂質過氧化，下調TGF-β1、Smad3 mRNA表達，上調Smad7 mRNA表達有關。本研究結果顯示，掃日勞-4味湯低劑量的改善效果最好，其具體原因有待進一步研究。本研究為進一步開展掃日勞-4味湯抗肺纖維化的機制研究奠定了基礎，也為肺纖維化的民族藥開發提供了新的參考依據。

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（收稿日期：2021-02-18 修回日期：2021-05-21）

（編輯：鄒麗娟）