大腸桿菌檢驗方法的探究與分析

劉慶紅，楊銘

（重慶市江津區疾病預防控制中心，重慶）

0 引言

人類及其他恒溫動物的糞便中含有致病菌，不過一般情況下由于數量比較少而在檢測上存在一定的困難。大腸桿菌也就是大腸埃希菌，是人和溫血動物腸道中檢出率最高的一種菌種[1,2]，如果從食物或者藥品中檢驗出大腸桿菌，則有可能意味著糞便對其造成了污染進而受到了致病菌的影響。故大腸桿菌常被看作是藥品受到糞便污染的指南菌種。在大腸桿菌、痢疾桿菌引發的腸炎及菌痢等疾病的治療中經常被使用的抗菌藥物有呋喃哇酮片。這種抗菌藥物具有較好的抗菌特性，但是在受到污染的呋喃哇酮片含有大腸桿菌的檢驗上存在一定的困難。用于檢驗大腸桿菌的方法有很多，但是適宜應用在呋喃哇酮片這類抗菌藥物的大腸桿菌的檢驗中的方法比較少。下面采用四種檢驗方法對呋喃哇酮片中大腸桿菌進行檢驗，探究哪種方法更適宜應用在呋喃哇酮片的大腸桿菌的檢驗中。

1 資料和方法

1.1 基本資料

備有呋喃哇酮片、不同孔徑的混合纖維素酯微孔濾膜、乳糖膽鹽培養液、含伊紅美藍瓊脂的大腸桿菌生化反應培養基以及大腸桿菌使用CMCC(B)44102。

1.2 方法

提取適量的呋喃哇酮片和大腸桿菌CMCC(B),制成研究所需要的供試液備用，供試液中含有大腸桿菌和呋喃哇酮成分。方法一：采用一次離心法，即采用轉速3000r/ min對供試液進行0.5h 的離心操作,提取適量的上清液。在乳糖膽鹽培養液中置入上清液，進行36℃±1℃、48h±2h的培養，對有無渾濁、產氣情況出現進行嚴密的觀察。在伊紅美藍瓊脂培養基上接種上清液實施平板分離檢驗，完成36℃±1℃、18-24h 的培養后，對該培養基上是否長出菌落進行嚴密的觀察。方法二：采用二次離心法，即采用轉速3000r/min 對供試液進行0.5h 的離心操作,提取足夠的上清液，以轉速3000r/min 再次實施0.5h 的離心操作，提取適量的上清液。在乳糖膽鹽培養液中置入上清液，進行36℃±1℃、48h±2h 的培養，對有無渾濁、產氣情況出現進行嚴密的觀察。在伊紅美藍瓊脂培養基上接種適量的上清液實施平板分離檢驗，完成36℃±1℃、18-24h 的培養后，對該培養基上是否長出菌落進行嚴密的觀察。方法三：采用離心-濾膜法，即采用轉速3000r/ min 對供試液進行0.5h 的離心操作,提取上清液通過0.45μm 混合纖維素酯微孔濾膜實施過濾,在乳糖膽鹽培養液中置入所得的溶液，進行36℃±1℃、48h±2h 的培養，對有無渾濁、產氣情況出現進行嚴密的觀察。在伊紅美藍瓊脂培養基上接種適量的所得溶液實施平板分離檢驗，完成36℃±1℃、18-24h 的培養后，對該培養基上是否長出菌落進行嚴密的觀察。方法四：采用離心-雙重濾膜法，即采用轉速3000r/min 對供試液進行0.5h 的離心操作,提取上清液分別通過3.0μm 和0.45μm 孔徑的混合纖維素酯微孔濾膜實施過濾。在乳糖膽鹽培養液中置入所得的溶液，進行36℃±1℃、48h±2h 的培養后，對有無渾濁、產氣情況出現進行嚴密的觀察。在伊紅美藍瓊脂培養基上接種適量的所得溶液實施平板分離檢驗，完成36℃±1℃、18-24h 的培養后，對該培養基上是否長出菌落進行嚴密的觀察。

1.3 觀察指標

以大腸桿菌的檢驗結果作為觀察指標。膽鹽乳糖培養液試驗中完成培養后發現渾濁(+)、產氣情況(+)存在于液體中，則視為有大腸桿菌 (+/+)檢出,反之視為無大腸桿菌檢出 (+/-、-/+、-/-)。伊紅美藍瓊脂培養基試驗中完成18-24h 的培養后發現金屬光澤的紫色菌落長在培養基上,則視為有大腸桿菌檢出(+),反之視為無大腸桿菌檢出(-)。

2 結果

一次離心法應用在大腸桿菌檢驗中的結果是乳糖膽鹽培養液稍微呈現出渾濁狀態，沒有產生氣體，伊紅美藍瓊脂培養基沒有長出菌落。二次離心法、離心-濾膜法應用在大腸桿菌檢驗中的結果是乳糖膽鹽培養液呈現出澄清狀態，沒有產生氣體,伊紅美藍瓊脂培養基沒有長出菌落、離心-雙重濾膜法應用在大腸桿菌檢驗中的結果是乳糖膽鹽培養液呈現出渾濁狀態，產生氣體,伊紅美藍瓊脂培養基中有顯著性的菌落長出。離心-雙重濾膜法檢出大腸桿菌，其他方法未檢出大腸桿菌。見表1。

表1 四類檢驗大腸桿菌的方法對吠喃哇酮片大腸桿菌的檢驗結果的對比

3 討論

大腸桿菌在人和溫血動物的腸道中存在，且數量多，隨著糞便排出體外，會對土壤、水源、食物、藥品等造成污染[3,4]。基于大腸桿菌是否存在于藥品中可以判定藥品是否被糞便所污染，一旦從藥品中檢出大腸桿菌，就意味著該藥品受到了糞便的污染，如果患者服用受到污染的飲品則有可能患上消化道傳染病[5,6]。故被看作糞便污染指南菌種的就包括大腸桿菌，檢驗大腸桿菌成為口服藥物常規檢驗項目之一[7,8]。為了探究哪種大腸桿菌檢驗方法適用在呋喃哇酮片這類本身具有抑菌特性的抗菌藥物的大腸桿菌檢驗中，進行了四類檢驗方法的對比分析，結果發現一次離心法、二次離心法、離心-濾膜法的乳糖膽鹽培養液試驗結果和伊紅美藍瓊脂培養基試驗結果顯示無大腸桿菌檢出，雖然一次離心法的應用顯示出乳糖膽鹽培養液有些許的渾濁，但這并不能意味著檢出大腸桿菌，這種渾濁情況的出現可能是因為離心不徹底。而離心-雙重濾膜法應用在大腸桿菌檢驗中的結果是乳糖膽鹽培養液呈現出渾濁狀態，產生氣體,伊紅美藍瓊脂培養基中有顯著性的菌落長出，視為檢出大腸桿菌。這種檢驗方法之所以對大腸桿菌的靈敏度高是因為其不但經過了離心操作還經過了兩次濾膜過濾,在一定降低了呋喃哇酮的藥物濃度，使之低于有效抑菌濃度。

由上可見，不同于其他三種檢驗方法，離心-雙重濾膜法應用在大腸桿菌檢驗中，其檢出大腸桿菌的概率更高一些，且具有操作簡便的優勢，更適宜在呋喃哇酮這類抗菌藥物大腸桿菌的檢驗中應用。