馬兜鈴酸誘導TM3小鼠睪丸間質細胞凋亡機制

陳 蓉，贠丹丹，黃文峰，柴艷梅，劉 丹，陳 群，周 成

(1.荊門市第二人民醫院，湖北 荊門 448000；2.西安醫學院第一附屬醫院風濕免疫科，陜西 西安 710077；3.西安交通大學公共衛生學院，陜西 西安 710061)

馬兜鈴酸(Aristolochic acids,AAs)天然存在于馬兜鈴屬、馬蹄香屬、細辛屬、線果兜鈴屬植物中。傳統中醫理論認為，馬兜鈴屬的中草藥具有利尿、抗感染、消炎和抗蛇毒等功效，也可用于支氣管炎、腎炎、前列腺炎等感染性疾病[1]。馬兜鈴酸主要包括馬兜鈴酸-Ⅰ和馬兜鈴酸-Ⅱ兩種形式，其中馬兜鈴酸-Ⅰ是毒性最強的成分。研究表明馬兜鈴酸具有很強的腎毒性，其代謝產物馬兜鈴內酰胺也具有腎毒性[2]。此外對馬兜鈴酸代謝過程研究發現，馬兜鈴酸可使RAS基因及P53基因發生突變，進而誘發腫瘤[3]。

細胞凋亡又稱細胞程序性死亡，在生物體的進化、內環境的穩定以及多個系統的發育中有重要作用。細胞凋亡受多基因嚴格控制，這些基因在種屬之間非常保守，如Bcl-2家族、Caspase家族、原癌基因C-myc等，但迄今為止細胞凋亡的確切機制尚不明確[4]。精子發生過程中生精細胞的凋亡對生精過程具有重要的意義。睪丸間質細胞(Leydig cell，LC)的主要功能表現為通過T細胞促進精子發育、雄性生殖器官的發育分化等[5]。近年來研究表明LC的凋亡受到多種因素及基因的調控，主要有Bcl-2、Caspase-3等[6]。有研究表明馬兜鈴酸可以通過干擾破壞線粒體代謝功能和結構而誘導線粒體損傷[7]。

近年來國內外文獻報道含有馬兜鈴酸的中草藥可以引起腎功能損害[8]。但馬兜鈴酸對LC的凋亡尚未見報道。我們有必要對馬兜鈴酸毒理性全面解讀，闡明引發中藥出現安全性問題的因素。本文旨在研究AAs能否誘導小鼠睪丸間質細胞系TM3細胞凋亡進行了探討，并對AAs引起細胞凋亡的意義進行討論。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑 小鼠睪丸間質細胞TM3購自中國科學院上海生命科學研究院；DMEM基礎培養基(Gibco，美國)；胎牛血清(Gibco，美國)；青-鏈霉素(Gibco，美國)；馬兜鈴酸-Ⅰ(Sigma，美國)，用DMSO溶解；CCK-8(Sigma，美國)；TUNEL(陜西脈元，中國)；Caspase-3、Caspase-9、Bax、β-actin抗體(Abcam，英國)；山羊抗兔IgG(H+L)和山羊抗小鼠IgG(H+L)抗體(Abcam，英國)；BCA 蛋白定量分析試劑盒和ECL 顯影試劑盒(Thermo，美國)。

1.2 儀 器 酶聯免疫檢測儀(Thermo，美國)；Light Cycler?96實時熒光定量PCR儀(Roche，美國)；CKX53倒置熒光顯微鏡(Olympus，日本)。

1.3 CCK-8法檢測細胞活力 取對數生長期的TM3細胞種于96孔板中，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養過夜，待細胞貼壁后，加入不同濃度的馬兜鈴酸-Ⅰ，并給對照組加入等體積的DMSO。每孔培養基體積為100 μl，每組設5個復孔。分別作用24、48、72 h后每孔加入10 μl CCK-8液，37 ℃作用30 min后用酶標儀450 nm處檢測各孔OD值。

1.4 TUNEL檢測凋亡 細胞經4%多聚甲醛固定后加入DNA末端轉移酶及帶標記的dNTP直接連接到DNA片段的3’-OH端，DAPI染細胞核，通過倒置熒光顯微鏡拍照觀察凋亡小體的數量檢測細胞的凋亡程度。結果判定：細胞核呈藍色，凋亡細胞呈綠色。

1.5 qRT-PCR檢測基因表達 將細胞種于6孔板中藥物處理48 h后，加入1 ml Trizol裂解細胞，再加入200 μl氯仿，4 ℃，12000 g離心15 min，加入等體積異丙醇，4 ℃，12000 g離心10 min，按照Takara逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄和PCR擴增反應。引物由上海金唯智公司合成。GAPDH基因上游引物：5’-AGAGAGGCCCAGCTACTCG-3’，下游引物： 5’-GGCACTGCACAAGAAGATGC-3’；Caspase-3基因上游引物：5’-GCTGGACTGCGGTATTGAGA-3’，下游引物：5’-TAACCGGGTGCGGTAGAGTA-3’；Caspase-9基因上游引物：5’-GACAAGGCCTTCGACAGTGA-3’，下游引物：5’-CCTGGGAAGGTGGAGTAGGA-3’；Bax基因上游引物：5’-GGTGAACTGGGGGAGGATTG-3’，下游引物：5’-AGAGCGATGTTGTCCACCAG-3’，PCR反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，生成溶解曲線，40個循環。定量PCR結果通過2-△△CT計算。

1.6 Western blot檢測蛋白表達 將細胞種于6孔板中藥物處理48 h后，加入細胞裂解液，通過BCA法測蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸，SDS-PAGE電泳，轉膜，封閉，一抗4 ℃孵育過夜，洗脫，二抗室溫孵育1 h，再次洗脫并顯影。

2 結 果

2.1 不同濃度AAs對TM3細胞活力的影響 見表1。不同濃度的AAs(2.5、10、25、100、400、1000 μmol/L)與對照組相比，小鼠睪丸間質細胞TM3的活力受到一定的抑制，顯示不同濃度的AAs處理TM3細胞24 h后對細胞活力無明顯影響，當濃度高于400 μmol/L時，細胞活力受到抑制；顯示不同濃度的AAs處理細胞48、72 h后，TM3細胞活力受到明顯抑制，且隨著AAs濃度的升高，細胞活力受抑制越明顯(P<0.05)。最終篩選出3個合適的濃度：25、100、400 μmol/L。細胞處理時間為48 h。

表1 不同濃度AAs對TM3細胞活力的影響(%)

2.2 TUNEL法檢測AAs對TM3細胞凋亡的影響 細胞發生凋亡時，染料可與DNA結合發綠色熒光，綠色熒光越多表明凋亡細胞越多。與對照組相比，25 μmol/L的AAs作用細胞48 h后細胞無明顯變化，當100 μmol/L的AAs作用細胞48 h后，可見明顯的凋亡細胞，隨著濃度升高，凋亡細胞增多(圖1)。

圖1 不同濃度AAs對TM3細胞凋亡的影響(TUNEL法，×200)

2.3 qRT-PCR檢測AAs對TM3細胞轉錄水平的影響 見表2。結果表明，不同濃度的AAs(25、100、400 μmol/L)處理細胞48 h后，Caspase-3轉錄水平表達升高，Caspase-9轉錄水平表達升高，Bax轉錄水平表達也升高(P<0.05)。

表2 不同濃度AAs對TM3細胞轉錄水平的影響

2.4 Western blot 檢測馬兜鈴酸對TM3細胞蛋白水平的影響 結果表明:不同濃度的AAs處理細胞48 h后，Caspase-3蛋白水平表達升高，Caspase-9蛋白水平表達升高，Bax蛋白水平表達升高(圖2)。

圖2 不同濃度AAs對Caspase-3、Caspase-9及Bax蛋白表達的影響

3 討 論

含有馬兜鈴酸的中藥有祛風散寒藥、止咳平喘藥、利尿通淋藥等，應用于多種疾病的治療。《中國藥典》中地方藥材富含馬兜鈴酸屬植物有二十余種。47種口服劑型的中藥可查詢到馬兜鈴屬植物類藥。近年來含AAs成分的中草藥引起腎臟損害受到廣泛的研究關注。利用AAs刺激人腎小管上皮細胞發現AAs可使線粒體膜通透性改變，造成線粒體腫脹、破壞[9]。實驗室研究證明，AAs能夠損傷腎小血管壁，造成腎小管管壁出現增生、增厚以及管腔狹窄等情況，引發一定程度的缺血缺氧[10]。亦有少數學者研究發現，細胞免疫機制可能參與馬兜鈴酸腎病(Ari-stolochic acid nephropathy，AAN)間質纖維化的形成[11]。此外，有研究顯示，P53信號轉導通路是AAN相關膀胱上皮癌的細胞周期標記，能夠促進急性AAN的腎損傷[12]。本實驗以小鼠睪丸間質細胞系TM3為研究對象，應用CCK-8法驗證了不同濃度的AAs可以引起小鼠睪丸間質細胞活力受到不同程度的抑制，且隨著AAs濃度的升高其抑制作用增強。細胞在發生凋亡時，基因組DNA斷裂時，暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉移酶(Terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT) 的催化下加上異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)標記的dUTP，從而可以通過熒光顯微鏡觀察到帶有綠色熒光。本研究通過TUNEL染色觀察到AAs可以引起小鼠睪丸間質細胞出現不同程度的凋亡，且凋亡細胞比例隨著濃度的升高而增高。這提示在體外條件下細胞凋亡在AAs所致小鼠睪丸間質細胞損傷中占有重要地位。

細胞凋亡是受基因調控的，目前研究比較多的有：Bcl-2家族、P53基因、Ras家族等。Bcl-2家族在細胞凋亡中起著重要作用[13]。Bax在Bcl-2家族起著促進細胞凋亡的作用，Bax能夠促進細胞色素C釋放，在傳遞過程中細胞色素C可以激活上游的Caspase-9，從而使Caspase-3發生活化[14]。有文獻研究表明AAs產生腎損傷過程中存在Caspase-3的激活，并在凋亡機制中扮演重要的角色[15-16]。研究表明AAs可以誘導細胞發生上皮間質轉化[17]。過表達Bcl-2對AAs引起的毒副作用具有保護機制[18]。AAs通過ERK 1/2途徑誘導腎小管上皮細胞發生自噬最終導致細胞凋亡[19]。我們通過qRT-PCR及Western blot等方法探討了AAs對TM3細胞凋亡的機制，結果表明，不同劑量的AAs可使Caspase-3、Caspase-9、Bax轉錄水平及蛋白水平表達均升高。較高濃度的AAs誘導TM3細胞發生凋亡，作用隨濃度增強增強。在低濃度(25 μmol/L)作用72 h后，我們沒有觀察到細胞凋亡發生，Caspase-3、Caspase-9、Bax無論蛋白水平還是轉錄水平均未發生明顯變化。本文實驗結果與其他學者研究結果均表明，AAs可以引起小鼠睪丸間質細胞發生凋亡[20]。

綜上所述，在體外條件下，一定濃度的AAs可明顯抑制TM3細胞生長并誘導其發生凋亡，通過對凋亡相關基因及蛋白Caspase-3、Caspase-9、Bax的檢測，我們認為AAs可能是通過Caspase途徑促進TM3細胞的凋亡來影響生殖細胞的發育。