促愈熏洗方促進肛瘺術后大鼠肛門部創面修復效果及機制探究

瞿 胤，張志君，蘆亞峰，鄭 德，陸 宏，楊 巍

(上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海201202)

肛門直腸瘺簡稱肛瘺，是指肛門周圍的膿腫潰破或切口引流引起的病變，與膿腫是同一種疾病的兩個階段[1-2]。肛瘺臨床表現為流膿、疼痛、瘙癢等局部癥狀，且反復發作，嚴重影響患者身心健康和生活質量[3-4]。目前，治療手段主要以手術為主，但術后也存在創面愈合周期長的難題。中醫外敷藥物治療瘡瘍由來已久[5]。大量臨床數據表明，促愈熏洗方對于肛瘺術后的創面修復有良好的療效[6-7]。陳剛等[8]構建全層皮膚缺損模型大鼠，發現促愈熏洗方可抑制炎癥因子水平，促進創面的愈合，但其具體作用機制尚不完全清楚。研究表明，轉化生長因子β1(TGF-β1)/Smad3信號通路在創面愈合、瘢痕形成過程中有重要作用[9]。基于此，本研究將從TGF-β1/Smad3信號通路方面，探究促愈熏洗方在肛瘺術后創面大鼠模型中的創面修復效果及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：健康SD大鼠，雄性，清潔級，6～8周齡，體重(200±20)g，由上海實驗動物研究中心提供，動物許可證號SCXK(滬)2019-0005。每日更換飼料，自由攝食飲水，室溫22～24 ℃，相對濕度40%～60%。

1.1.2 藥物制備：促愈熏洗方由蒲公英、苦參、 當歸、虎杖和五倍子組成：蒲公英、虎杖各30 g，五倍子15 g，苦參、當歸各9 g，用水煎煮2次，3 h/次，第1次10倍量水，第2次為5倍量水，去渣存液。

1.1.3 主要試劑與儀器：高錳酸鉀(吉林省東盟制藥)，ELISA試劑盒(南京森貝伽)，蛋白抗體(美國Abcam)；激光多普勒血流儀(英國Moor Instruments)，多功能酶標儀(美國Bio-Rad)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組：40只大鼠隨機分為對照組、肛瘺模型組、促愈熏洗方組和高錳酸鉀組(陽性對照)，每組10只。各組大鼠分籠飼養，適應性喂養7 d。

1.2.2 造模與處理：參照文獻采用綜合法建立肛瘺術后創面大鼠模型[10]，腹腔注射100 mg/kg氯胺酮麻醉大鼠，剃除肛門部手術區毛發備皮并消毒，于肛管旁作直徑2.5 cm圓形皮膚傷口，同時切開肛管，傷口深達肌肉層約0.3 cm，止血后在創面加1 ml糞液，并用油紗、敷料和膠帶固定48 h，若傷口有膿性分泌物、糞臭味，提示造模成功。對照組大鼠制作相同的肛門部肌層傷口，但不敷糞液。促愈熏洗方組取藥劑以1∶4稀釋后擦洗大鼠創面，紗布包扎，2次/d。高錳酸鉀組以1∶5000稀釋后擦洗創面，紗布包扎，2次/d。對照組和模型組以生理鹽水擦洗，紗布包扎，2次/d。各組大鼠均連續干預14 d。

1.2.3 創面觀察及局部血流監測：于術后3 d和藥物干預結束后，采用透明格子膠片測量局部創面面積，創面愈合率=(原始創面面積術后3 d-當前創面面積藥物干預結束)/原始創面面積術后3 d×100%。應用激光多普勒血流儀，記錄隨機3處創面血流情況，并經Power Lab Chart數據采集分析系統計算3處創面血流值，取均值為最終結果。

1.2.4 新生毛細血管數檢測：藥物干預結束后，取大鼠肛管相近處的肉芽組織，經甲醛固定后制成石蠟切片，進行免疫組化染色，以CD31抗體標記新生毛細血管，200倍鏡下計數棕色新生毛細血管數。

1.2.5 血管生長相關因子和炎癥因子檢測：藥物干預結束后，取大鼠肛管相近處的肉芽組織，勻漿分離上清，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)，操作嚴格參照ELISA 試劑盒說明，檢測血管生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、促血管生成素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，Ang-Ⅱ)、胰島素樣生長因子1受體(Insulin-like growth factor 1，IGF-1R)、血小板源生長因子(Platelet derived growth factor，PDGF)、白細胞介素及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量。

1.2.6 TGF-β1/Smad3信號通路蛋白表達檢測：藥物干預結束后，取大鼠肛管相近處的肉芽組織，加入RIPA裂解液勻漿提取蛋白，各組取等量蛋白進行10%SDS-PAGE凝膠分離，轉膜后置于脫脂牛奶中封閉2 h，再加入各目的蛋白一抗(TGF-β1 1∶1500、Smad3 1∶1000、p-Smad3 1∶1000)，4 ℃孵育過夜，次日加入相應的蛋白二抗(1∶8000)，室溫下孵育1 h，最后暗室曝光掃描條帶，目的蛋白的相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值。

1.3 統計學方法 應用SPSS 18.0統計學軟件進行分析，數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠創面情況比較 見表1。與對照組比較，肛瘺模型組創面愈合率、局部血流量和新生毛細血管數均降低(P<0.05)；與肛瘺模型組比較，促愈熏洗方組和高錳酸鉀組創面愈合率、局部血流量和新生毛細血管數均升高(P<0.05)，且促愈熏洗方組高于高錳酸鉀組(P<0.05)。

表1 各組大鼠創面情況比較

2.2 各組大鼠肉芽組織血管相關生長因子水平比較 見表2。與對照組比較，肛瘺模型組肉芽組織中VEGF、Ang-Ⅱ、IGF-1R及PDGF表達均降低(P<0.05)；與肛瘺模型組比較，促愈熏洗方組和高錳酸鉀組VEGF、Ang-Ⅱ、IGF-1R及PDGF表達均升高(P<0.05)，且促愈熏洗方組高于高錳酸鉀組(P<0.05)。

表2 各組大鼠肉芽組織血管相關生長因子水平比較

2.3 各組大鼠肉芽組織炎癥因子水平比較 見表3。與對照組比較，肛瘺模型組肉芽組織中IL-6、IL-12、IL-1β及TNF-α表達均升高(P<0.05)；與肛瘺模型組比較，促愈熏洗方組和高錳酸鉀組IL-6、IL-12、IL-1β 及TNF-α表達均降低(P<0.05)，且促愈熏洗方組低于高錳酸鉀組(P<0.05)。

表3 各組大鼠肉芽組織炎癥因子水平比較

2.4 各組大鼠肉芽組織TGF-β1/Smad3信號通路表達比較 見表4(圖1)。與對照組比較，肛瘺模型組肉芽組織中TGF-β1、p-Smad3/Smad3表達均下調(P<0.05)；與肛瘺模型組比較，促愈熏洗方組和高錳酸鉀組TGF-β1、p-Smad3/Smad3表達均上調(P<0.05)，且促愈熏洗方組高于高錳酸鉀組(P<0.05)。

表4 各組大鼠肉芽組織TGF-β1/Smad3信號通路表達比較

A：對照組；B：肛瘺模型組；C：促愈熏洗方組；

3 討 論

由于肛瘺術后創口為開放性創口，容易被糞便污染，延長創口愈合時間，部分患者愈合時間可能超過4周。目前對于創面愈合延遲的機制研究較多，普遍認為創面的反復污染引起的持續性炎癥反應，不利于細胞增殖和組織重塑[11]。因此，減輕炎癥反應刺激，促進肛周組織細胞增殖，是促進肛瘺術后創口愈合的重要因素。本研究采用綜合法建立肛瘺術后創面大鼠模型，符合臨床病理特點[12]。

中醫認為，肛瘺是肛癰潰后余毒結滯，或臟腑素虛，復感外邪，腑氣壅阻，化腐成膿而成[13]。促愈熏洗方由蒲公英、苦參、 當歸、虎杖和五倍子組成，方中以苦參為君藥，有清熱燥濕之效，臣以虎杖、蒲公英祛風利濕、清熱解毒，佐以當歸補血活血，五倍子收濕斂瘡，諸藥合用共奏清熱燥濕、活血化瘀之功，可針對肛瘺術后創面修復的治療。《醫學流源論》[14]中記載“外科之法最重外治”，表明外治法是中醫治療皮膚創面類疾病的重要方法。本研究結果顯示，促愈熏洗方可明顯加速模型大鼠創面的愈合，與既往臨床研究成果相符[15]。

炎癥反應與創口血運在創面愈合中占據重要地位。創面愈合過程中，中性粒細胞、巨噬細胞等炎性細胞會浸潤至損傷部位，分泌合成大量炎性因子IL-6、IL-12、IL-1β及TNF-α等，爆發級聯式炎癥反應，接著進入創傷修復的細胞增殖和組織重塑階段，而血管新生是這一階段的關鍵[16-17]。VEGF、PDGF、表皮生長因子、胰島素樣生長因子等是創傷后愈合最重要的生長因子，而Ang-Ⅱ在創傷后病理性血管生成中有重要的促進作用[18-19]。本研究結果顯示，肛瘺模型大鼠創口局部血流量和新生毛細血管數減少，肉芽組織中VEGF、Ang-Ⅱ、IGF-1R及PDGF表達降低，IL-6、IL-12、IL-1β及TNF-α表達升高，經促愈熏洗方治療后上述指標明顯改善，表明促愈熏洗方可降低炎癥因子水平，減輕創面損傷，還可促進血管生長相關因子，加快創面局部血運重建，為組織修復提供營養條件。

TGF-β1被認為是成纖維細胞的強效趨化因子，不僅可調節細胞外基質蛋白合成和降解，還可刺激肉芽組織的形成[20]。創口愈合過程中，TGF-β1可活化TGF-β1受體激酶的底物Smad3，將TGF-β1傳遞至核內直接作用于DNA，調節靶基因的轉錄[21]。本研究中，肛瘺模型大鼠肉芽組織中TGF-β1/Smad3活性明顯受到抑制，經促愈熏洗方治療后TGF-β1/Smad3上調，提示促愈熏洗方可能通過TGF-β1/Smad3信號通路，促進細胞增殖，加速創面的愈合。

綜上所述，促愈熏洗方可有效促進肛瘺術后創面大鼠模型的創面愈合，改善局部血流，可能與通過活化TGF-β1/Smad3信號通路，促進血管生長相關因子表達，抑制炎癥因子表達有關。但促愈熏洗方是否有其他途徑促進大鼠肛門部創面愈合，還需要大量實驗進一步探究，以期為促愈熏洗方的臨床應用提供科學數據支撐。