白芥子散對哮喘大鼠免疫穩態重建及RhoA基因表達的影響

陳訓春，李名蘭，潘碧云，王燕英

(海口市人民醫院，海南 海口 570208)

非特異性刺激導致的氣道狹窄是呼吸系統阻塞性疾病，支氣管哮喘特征之一。雖然其病理生理學機制還不十分清楚，現在已經提出了幾種機制來解釋氣道高反應性(Airway hyperresponsiveness，AHR)，包括控制氣道平滑肌的神經系統的改變[1]，氣道黏膜分泌物的增加[2]，以及與氣道重塑有關的機械因素等[3]。此外，還有研究人員認為導致哮喘患者氣道狹窄與氣道平滑肌異常有關[4-5]。通過吸入β-受體興奮劑來快速緩解哮喘癥狀也提示氣道平滑肌收縮可能參與了哮喘患者的氣道阻塞。因此，研究在哮喘的發生發展過程中與氣道平滑肌收縮有關的分子非常重要。研究發現，平滑肌收縮主要受細胞質內Ca2+濃度的調節。最近，另一種稱為Ca2+致敏的機制被認為與激動劑引起的平滑肌收縮有關[6-7]。有研究結果顯示，雖然詳細機制尚不完全清楚，有增加證據表明單體GTP結合蛋白RhoA及其下游分子Rho激酶參與Ca2+致敏機制[6-7]。當RhoA/Rho激酶系統被激動劑激活后，肌球蛋白輕鏈(Myosin light chain，MLC)磷酸酶水平降低，MLC磷酸化水平增加，導致平滑肌收縮增加。最近的研究顯示，一些疾病患者的平滑肌中RhoA/Rho激酶系統介導的Ca2+致敏機制增加，包括冠心病[8]、感染性休克[9]和高血壓[10]。但是，有關RhoA/Rho激酶系統在支氣管哮喘中的作用卻少有研究。白芥子散以白芥子、延胡索、甘遂、細辛、麻黃按 2∶2∶1∶1∶1 比例混合，具有辛溫散寒、化痰通絡、溫陽益氣的功效。臨床上用于治療咳嗽、慢性支氣管炎等疾病[11-12]。但是，關于其在支氣管哮喘中的作用卻少有研究。本研究旨在探討白芥子散對哮喘大鼠免疫穩態重建及其對于RhoA基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 Wistar大鼠(6周齡，SPF級，雄性)，體重170～190 g，購于中國醫科大學實驗動物中心。動物實驗前1周開始飼養于動物中心實驗動物房，平均溫度(25±2)℃，無卵蛋白飲食，每天12 h自然光光照，12 h無光照。

1.2 分組與造模方法 根據隨機數字表法將60只Wistar大鼠分為六組，A組(正常對照組)、B組(陰性對照組)、C組(哮喘模型組)、D組(地塞米松組)、E組(白芥子散2 h組)和F組(白芥子散4 h組)，每組10只。除A組和B組外，其他所有組均根據改良的Palmans方法建立哮喘模型[13]。在第1天和第8天通過皮下注射1 ml含10 mg OVA和100 mg Al(OH)3的生理鹽水懸浮液使每只模型大鼠致敏(B組注射1 ml生理鹽水)。 15 d后，將它們放置在透明的玻璃箱中，每隔30 min 1次，每隔1 d使用1% OVA生理鹽水溶液刺激哮喘(B組用生理鹽水霧化)。直到第56天霧化結束。在上一次氣溶膠觀察模型后，模型出現打噴嚏、明顯的腹部呼吸、無力、鼻癢、抓撓和反應緩慢等癥狀時，認為造模成功。

1.3 實驗方法 在第56天，建立所有模型后，正常喂養大鼠14 d，等待它們進入緩解期。 第15天開始集體治療。 A組和B組正常進食；C組隔天腹腔注射地塞米松，每次0.5 mg/kg。 將D組大鼠的背部剃光，并在肺俞、脾俞和腎俞的兩側(定位參見“實驗性針灸法”[14])應用0.8 cm×0.8 cm的白芥子散膏藥，用膠帶固定，分別在2 h和4 h后取下，每兩天治療1次，共7次。

1.4 標本采集 實驗結束將大鼠用10%水合氯醛(0.3 ml/100 mg)麻醉，仰臥位固定，右腹股溝處取動脈血至采血管中，置管30 min，3000 r/min離心，提取血清分裝入凍存管中，-20 ℃凍存備用。沿胸部正中線暴露大鼠胸腔，取右肺中葉置于10%甲醛溶液固定備用。

1.5 指標檢測

1.5.1 HE染色：右肺中葉常規石蠟包埋、切片。常規HE染色。炎性細胞是指氣管周圍及肺組織內的中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞，染為藍色。

1.5.2 ELISA檢測：酶標儀采用HBS-1096C Pro自動酶標儀(上海科懷儀器有限公司)，TNF-α和IL-6的酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒由北京普爾韋耶生物技術有限公司生產。按照試劑盒說明書的嚴格操作，通過ELISA檢測支氣管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-6的水平。

1.5.3 Western blot檢測：收集細胞。 用PBS緩沖液沖洗，添加RIPA裂解緩沖液，并在冰浴條件下攪拌30 min以提取總細胞蛋白。 離心15min(15000 r/min)后，通過BAC方法測量細胞總蛋白，通過瓊脂糖凝膠電泳分離蛋白，轉移并標記蛋白，洗脫TBS顯色，通過UVP凝膠收集圖像，并讀取Western條帶。

1.6 統計學方法 采用SPSS 17.0統計學軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差表示，采用組間t檢驗分析。計數資料以[例(%)]表示，采用卡方檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 肺泡組織HE染色 如圖1所示，A組和B組肺泡結構完整，沒有炎癥和水腫的表現(圖1A和1B)。 C組肺泡結構破壞顯著，表現出肺水腫，肺泡塌陷和大量炎性細胞浸潤(圖1C)。采用地塞米松和白芥子散治療2 h和4 h后肺泡結構的破壞，炎性細胞的浸潤明顯減輕(圖1D-F)。

A：正常對照組；B：陰性對照組；C：哮喘模型組；D：地塞米松組；E：白芥子散2 h組；F：白芥子散4 h組

2.2 各組支氣管肺泡灌洗液細胞計數比較 見表1。與正常對照組相比較，哮喘模型組支氣管肺泡灌洗液中的總細胞、中性粒細胞和巨噬細胞的數量均顯著增加(均P<0.05)。 地塞米松和白芥子散2 h和4 h治療顯著減少了支氣管肺泡灌洗液中的總細胞、中性粒細胞和巨噬細胞的數量。

表1 各組支氣管肺泡灌洗液細胞計數(×108/L)

2.3 各組支氣管肺泡灌洗液內TNF-α和IL-6水平比較 見表2。與正常對照組相比較，哮喘模型組支氣管肺泡灌洗液中的TNF-α和IL-6水平均顯著增加(均P<0.05)。 地塞米松和白芥子散2 h和4 h治療顯著減少了支氣管肺泡灌洗液中的TNF-α和IL-6水平。

表2 各組支氣管肺泡灌洗液內TNF-α和IL-6水平比較

2.4 各組肺組織中RhoA表達水平比較 與正常對照組相比，哮喘模型組肺組織中RhoA表達顯著增加。地塞米松和白芥子散2 h和4 h治療顯著減少了肺組織中的RhoA表達水平(圖2)。

圖2 肺組織中RhoA表達水平

3 討 論

以往研究發現，哮喘患者的AHR與氣道平滑肌異常相關[4-5]。平滑肌是氣道的主要組織結構，并且在氣道收縮中發揮了重要的作用。氣道平滑肌的過度收縮可能是引起哮喘癥狀，例如AHR的直接關鍵因素之一[15]。研究發現，在過敏性支氣管哮喘大鼠模型中，激動劑誘導的RhoA介導的Ca2+致敏性氣道平滑肌收縮伴有RhoA蛋白表達水平的增加[16]。此外，體內實驗結果顯示，吸入激動劑如Ach和神經激肽A也會導致AHR的發生。類似的實驗結果，包括體內AHR、支氣管平滑肌高反應性，以及RhoA介導的Ca2+致敏性氣道平滑肌收縮在卵清蛋白抗原誘導的支氣管哮喘大鼠模型中得到了證實。RhoA及其下游分子Rho激酶在人支氣管平滑肌收縮中的重要性也得到了驗證。因此，現在已經有科學家提出RhoA/Rho激酶途徑可以作為治療哮喘的新靶點[17]。

白芥子散中的白芥子辛溫、利氣、豁痰、寬胸；細辛祛風散寒、溫肺化飲；甘遂逐水利腸、宣通肺氣；延胡索行氣活血；鮮姜汁辛溫、歸肺經、溫肺散寒、利氣豁痰、止咳平喘；麻黃宣肺、散寒、平喘。貼敷的穴位以背俞穴為主，而在背為陽，背俞穴又是五臟六腑之氣輸注和匯聚的部位，故藥物敷貼產生的藥力和熱力可通過穴位的刺激作用，促進臟腑功能活動的良性運轉。如《難經·六十七難》所言：“陰病行陽，陽病行陰。故令募在陰，俞在陽”。現代醫學研究認為：穴位給藥的生物利用度明顯高于一般給藥，因腧穴對藥物具有敏感性和放大效應。本研究結果顯示，與正常對照組相比，哮喘模型組肺組織中RhoA蛋白質表達顯著增加。這是與以往的研究結果相一致的[16]。而地塞米松和白芥子散2 h和4 h治療顯著減少了肺組織中RhoA蛋白質的表達水平，提示白芥子散可能是通過抑制RhoA基因蛋白質的表達而抑制支氣管平滑肌收縮，從而改善哮喘癥狀。

此外，本研究還發現，白芥子散治療方法可以減少炎癥細胞的浸潤，肺組織和支氣管肺泡灌洗液中的炎癥細胞數量均明顯減少。其機制可能是炎癥細胞，例如中性粒細胞和巨噬細胞的遷移需要肌動蛋白細胞骨架的重塑，而單體GTP結合蛋白RhoA、Rac1和Cdc42是肌動蛋白重組的關鍵調節因子[18]。因此，白芥子散可能是通過抑制RhoA的表達而抑制了炎癥細胞的遷移和浸潤。

研究發現，促炎細胞因子表達水平增加出現在支氣管哮喘的早期階段。在各種促炎細胞因子中，已報道TNF-α和IL-6在支氣管哮喘的發生發展中起著重要的作用[19]。動物實驗結果顯示，卵清蛋白抗原注射后，TLR4介導的NF-κB活化增強，導致TNF-α和IL-6的產生，并且這兩種細胞因子反過來也會激活NF-κB[20]。這種正反饋可以放大原先的炎癥反應，并在卵清蛋白抗原誘導的支氣管哮喘發病機制中發揮重要的作用。在本研究中，白芥子散治療方法可以減少支氣管肺泡灌洗液中的TNF-α和IL-6水平，其機制可能與白芥子散下調活化的NF-κB，從而阻止了促炎細胞因子的級聯反應并限制炎癥反應相關。

綜上所述，白芥子散可改善抗原誘導的大鼠哮喘，幫助其免疫穩態的重建，其作用機制可能是通過減少RhoA基因的蛋白質表達水平而實現的。