苦參堿對宮頸癌細胞中Bcl-2/Bax表達水平及生物學行為的影響

楊 繁，曾永蕾

(1.安徽中醫藥大學，安徽 合肥 230038；2.安徽中醫藥大學第二附屬醫院，安徽 合肥 230038)

宮頸癌是威脅女性身體健康的癌癥之一，陰道觸碰性流血、陰道排出白色或血色液體及有腥臭味道是宮頸癌常見的臨床特征，發病群體無規律性[1]。根據我國流行病調查顯示：我國每年有10萬新增宮頸癌患者，以每年1.0%增長。宮頸癌疾病多為機體感染HPV病毒導致，HPV屬于DNA病毒，具有快速復制和繁殖的特點[2]。隨著宮頸癌篩查力度的增加，該疾病在早期能夠被發現，臨床手術及放化療均可以降低死亡率，但是毒副作用的增加，導致宮頸癌治療受限，因此，尋找新的藥物至關重要[3]。近些年，從植物中提取有效成分應用于抗腫瘤的研究逐漸增多，苦參堿是從豆科植物提取的生物堿類，苦參是其中主要成分之一，在抑制炎癥、抵抗病毒方面具有重要作用。幾年來在廣譜抗腫瘤的作用中備受關注，對肝癌、胃癌細胞均具有較好的抑制作用[4]。凋亡蛋白家族，Bax為促進凋亡，Bcl-2、Bcl-xl作用與之相反[5]，均參與癌細胞的凋亡及增殖，但是在宮頸癌細胞中的作用還有待商榷，因此，本文主要探討苦參堿對宮頸癌細胞中Bcl-2/Bax表達水平及生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 宮頸癌Hela細胞株(美國ATCC公司)；苦參堿(上海源葉生物科)；鼠抗人Bcl-2、Bax抗體(Santa Cruz公司，USA)；RPMI1640培養基(上海邦景)；電泳儀(美國伯樂公司)。

1.2 苦參堿溶液配制 將苦參堿溶于濃度<0.1的二甲基亞砜溶液中，-2 ℃保存，無血培養基稀釋為1.0、1.5、2.0 mg/ml。

1.3 宮頸癌Hela細胞株培養與分組 將低溫冷藏的Hela細胞，快速移入37 ℃水中溶解，離心后，離棄上清液，加入培養基，無氧下培養，每隔一日更換培養液，生長到85%～90%時，消化傳代，把無苦參堿處理的Hela細胞分為宮頸癌組，加入1.0、1.5、2.0 mg/ml濃度藥物的細胞分為藥物組。

1.4 MTT法檢測Hela細胞抑制率 采用10%FBS將濃度為1000 ng/μl的苦參堿溶液分別調整濃度為1.0、1.5、2.0 g/L，取Hela細胞數目為5×103接種到96孔板中，宮頸癌組未加入藥物，藥物組加入多個濃度以上苦參堿藥物溶液，培養24、48、72 h，后加入20 μl MTT，4 h后，加入150 μl DMSO，采用酶標儀測570 nm波長檢測每個孔Hela細胞的抑制率。

1.5 檢測Hela細胞遷移能力 Hela細胞進行饑餓處理，12 h后再加入DMSO，24 h后離心重懸細胞5×103/ml，將200 μl的細胞懸液加入小室中，下室中加入含20%血清的培養基600 μl，37 ℃，培養2～3 d，取出小室，用棉簽拭去上室細胞，進行染色，計算Hela細胞數。

1.6 流式細胞儀檢測Hela細胞凋亡 將Hela細胞以5×103個數量種于96孔板，過夜培養后按上述分組分別加入不同的藥物濃度，培養1 d后，加入少量胰蛋白酶，消化4 min后，收集細胞進行離心，棄去上清液，采用PBS反復洗滌3次，后進行避光染色，后采用流式細胞儀分析Hela細胞凋亡。

1.7 免疫印跡檢測Bcl-2、Bax蛋白 100 μl濃度為5×103的Hela細胞溶液，高速離心0.5 h，收集上清液。將蛋白上清處理后加入上樣孔。電泳后，取下PVDF膜TBST浸泡10 min，室溫封閉2 h,TBST洗5 min、3次，然后加一抗(1∶500 ),4 ℃雜交24 h，TBST洗5 min、3次，加過氧化物酶標記的二抗(1∶2000)，室溫下雜交2 h，再次TBST洗5 min、3次。將膜浸入ECL工作液，隨后進行檢測，獲取圖像。

2 結 果

2.1 苦參堿干預下Hela細胞活性抑制率 見表1。MTT結果顯示：宮頸癌組Hela細胞活性抑制率低于藥物組(P<0.05)，2 g/L藥物組Hela細胞活性抑制率高于1.0、1.5 g/L藥物組(P<0.05)，同一組中，72 h Hela細胞活性抑制率高于24、48 h(P<0.05)，隨著藥物濃度及時間延長Hela細胞活性抑制率逐漸升高。

表1 苦參堿干預下Hela細胞活性抑制率(%)

2.2 苦參堿對Hela細胞侵襲數目的影響 1 g/L藥物組Hela細胞侵襲數目低于宮頸癌組(P<0.05),2 g/L藥物組Hela細胞侵襲數目低于1、1.5 g/L藥物組(P<0.05)，四組細胞侵襲數目差異比較有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

2.3 苦參堿對Hela細胞凋亡周期及凋亡率的影響 見表2。G0-G1期宮頸癌組細胞凋亡與藥物組差異具有統計學意義(P<0.05)，G0-G1期、G2-M期各組相差較小(P>0.05),2 g/L藥物組Hela細胞凋亡率最高，宮頸癌組細胞凋亡率最低，四組Hela細胞凋亡率比較差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 苦參堿對Hela細胞凋亡周期及凋亡率的影響

2.4 苦參堿對Bcl-2、Bax蛋白水平的影響 見表3(圖2)。1 g/L藥物組Hela細胞下Bcl-2蛋白水平低于宮頸癌組(P<0.05)，2 g/L藥物組Hela細胞下Bcl-2蛋白水平低于1、1.5 g/L藥物組(P<0.05)，Bax表達與Bcl-2相反。

表3 Hela細胞Bcl-2、Bax蛋白水平

3 討 論

苦參堿屬于中藥生物調節劑，對多種惡性腫瘤細胞存在潛在的抵抗作用，例如：肺癌、肝癌和胃癌等[6]。本文通過采用不同濃度的苦參堿對Hela細胞進行干預，發現Hela細胞活性顯著降低，向周圍擴散的能力減慢，在苦參堿劑量增加的同時細胞凋亡與劑量成正相關。

目前抗腫瘤藥物對宮頸癌Hela細胞的抑制方式有很多，如抑制細胞活性、促進凋亡、減少侵襲等。本文通過MTT檢測發現苦參堿可以抑制Hela細胞活性，在72 h時和濃度為2 g/L時細胞活性抑制率達到頂峰。近些年，從植物中提取抗腫瘤的藥物的研究表現出了巨大的潛力，苦參堿屬于中藥提取物，是從苦參根部提取出的堿性成分物質。藥理學研究表明，苦參堿能夠通過對Hela細胞中線粒體活性進行干預，誘發癌細胞基因發生甲基化模式，調節Hela細胞信號，抑制腫瘤細胞活性，加快宮頸癌細胞凋亡發揮抗腫瘤的作用[7-8]。毛燕等[9]研究表示苦參堿還能夠通過激活機體免疫因子，抑制Hela細胞活性發展，并有效降低細胞毒性，減緩宮頸癌病變，本文與之結果相似。

本文研究表示，苦參堿可以加快Hela細胞凋亡，減少侵襲，隨著苦參堿濃度的升高，凋亡加劇，侵襲數量降低，說明苦參堿能夠促使宮頸癌細胞存活周期縮短，減少擴散。眾所周知，細胞受多種信號調節進行多種生物活動，但是，當細胞發生DNA突變時，信號產生抑制，機體平衡狀態遭到破壞，癌細胞產生[10]。苦參堿能夠通過不同作用形式加快Hela細胞凋亡，對宮頸癌細胞的凋亡信號進行調節，能夠減少腫瘤血管內皮細胞分化，并發揮抗Hela細胞黏性作用，減少Hela細胞的侵襲和遷移[11-12]。許海等[13]研究表示苦參堿能夠對宮頸癌組織進行有效干預，減少毒性和炎癥浸潤，緩解組織病變。本文與張悅等[14]研究結果相似。

隨著對細胞凋亡機制的研究，發現Bcl-2家族在多種惡性腫瘤細胞的凋亡中發揮作用。其下游因子分為不同亞型，Bcl-2能夠減少宮頸癌細胞壞死，Bax作用與之相反[15-16]。苦參堿具有促進癌細胞壞死作用，均能夠與線粒體和核孔復合體的信號傳導作用，增加腫瘤細胞壞死，縮短癌細胞存活期[17]。Jie等[18]研究表示，體外實驗研究表明對宮頸癌Hela細胞經苦參堿干預，無干預下的宮頸癌細胞Bcl-2水平活躍，干預后下的癌細胞Bcl-2水平降低，同時能夠減少生物活性，縮短生存時間。研究表示，苦參堿對惡性腫瘤具有抑制作用一致時學術界研究的中藥，金暢等[19]研究表示利用苦參堿可以輔助治療宮頸癌患者，對患者免疫調節具有較好的作用。趙林等[20]研究表示Bcl-2與Bax在宮頸癌細胞作用呈現負相關，Bcl-2降低，Bax上升，Bcl-2、Bax對宮頸癌DNA表型調節發揮重要作用。

綜上所述，苦參堿抑制宮頸癌Hela細胞活性，加快Hela凋亡，減少向周圍細胞擴散的能力，上述原因可能與抑制Bcl-2表達，增加Bax水平相關。