聚苯胺超分子水凝膠固定化果膠酶的研究

郝紅英，馬金玲，詹海鵑，劉萬毅，畢淑嫻

（寧夏大學化學化工學院，省部共建煤炭高效利用與綠色化工國家重點實驗室，化學國家級實驗教學示范中心，寧夏 銀川 750021）

果膠酶是一種可以使果汁、果酒澄清，降低果膠加工過程中營養物質損耗的一種酶。降低果蔬等榨汁的黏度、提高過濾效率的同時減少化學澄清劑的用量，從而改善果汁的質量[1]。游離的果膠酶具有反應后不能回收、不能實現重復利用等缺點。而固定化酶在一定程度上彌補了這些缺點，還能防止外源物質對果品的污染，提高酶的使用效率[2-6]。

水凝膠是通過物理交聯或化學交聯，而得到的具有三維網絡結構體系的親水高分子聚合物。不溶于水，但能吸收大量的水溶脹。正是由于這樣的結構特征，水凝膠才會被大量地應用于細胞分離與培養、藥物控制釋放、固定化酶等領域[7-10]。

本文以戊二醛（glutaraldehyde，GA）為交聯劑制備聚苯胺基超分子-戊二醛（polyaniline based supramolecular hydrogels-glutaraldehyde，PPH-GA）復合材料作為酶的固定化載體，固定果膠酶并研究其催化性能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3-氨基苯硼酸鹽（98%）、聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）：天津市凱通化學試劑有限公司；苯胺（aniline，AN）、過硫酸銨（ammonium persulfate，APS）：煙臺市雙雙化工有限公司；戊二醛：天津市大茂化學試劑廠；濃鹽酸：天津市北聯精細化學品開發有限公司；氫氧化鈉、無水亞硫酸鈉、果膠酶（>50 000 U/g）：上海瑞永生物科技有限公司；檸檬酸：徐州天鴻化工有限公司；檸檬酸鈉、果膠、酒石酸鉀鈉、3，5-二硝基水楊酸：上海廣諾化學科技有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器

RH數顯型磁力攪拌器：德國艾卡公司；JD200-4電子分析天平：沈陽龍騰電子有限公司；D2F-6050真空干燥箱：上海慧泰儀器制造有限公司；SHA-C數顯恒溫振蕩器：金壇市杰瑞爾電器有限公司；UV-1800PC紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；PSHJ-5 pH計：西安精密儀器儀表有限公司。

1.3 固定化酶的制備及其性能研究

1.3.1 固定化酶載體制備

先將2 mmol過硫酸銨（APS）溶于1 mL去離子水作為A溶液。將1.5 mmol的苯胺（AN）加入3 mL 10%去離子水制得的聚乙烯醇溶液，再加入0.105 mmol的3-氨基苯硼酸鹽酸鹽、800 μL 6 mmol/L 的 HCl和197.5 μL去離子水混合作為B溶液。將上述溶液A和溶液B冷卻至0℃，取802.5 μL溶液A與溶液B迅速混合，反應6 h。將4%戊二醛（GA）和PPH按一定比例加入小燒杯中，磁力攪拌交聯10 h后用蒸餾水反復離心洗滌多次，制備出PPH-GA復合材料[11]。

1.3.2 材料表征

1.3.2.1 傅立葉紅外光譜分析（Fourier transform infrared spectrometer，FT-IR）

采用KBr壓片法，在光譜范圍為4 000 cm-1～500 cm-1，分辨率為0.5 cm-1的條件下，用紅外光譜儀測定PPHGA復合材料的結構特征。

1.3.2.2 掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）

采用SEM測試方法，在不同的放大倍數下觀察PPH-GA復合材料的形貌特征。

1.3.3 固定化酶的制備

1.3.3.1 3，5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）試劑的配制

稱取3，5-二硝基水楊酸10 g溶于蒸餾水中，加入20 g氫氧化鈉、200 g酒石酸鉀鈉和500 mL水加熱溶解。之后加入5 g苯酚、5 g無水亞硫酸鈉，待全部溶解后定容至1 000 mL，儲存于棕色瓶中，放置7 d后使用。

1.3.3.2 pH 3.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液的配制

稱取檸檬酸21.01 g溶解后定容至1 000 mL。稱取29.41 g檸檬酸鈉溶解后定容至1 000 mL。取一定量的檸檬酸、檸檬酸鈉溶液混合用pH計測定pH值為3.5。

1.3.3.3 1%果膠溶液的配制

用分析天平稱取果膠1 g用pH 3.5的緩沖溶液溶解，定容至100 mL。

1.3.3.4 1%果膠酶溶液的配制

用分析天平稱取果膠酶1 g用pH 3.5的緩沖溶液溶解，定容至100 mL。

1.3.3.5 固定化酶的制備

稱取制備的PPH-GA復合材料0.08 g，加入1%果膠酶溶液2 mL，在37℃恒溫振蕩器中反應4 h。取出后倒出上清液保存，待測載酶量。沉淀先用蒸餾水清洗，再用緩沖溶液清洗除去多余的自由酶。放置4℃冰箱中保存。

1.3.4 固定化果膠酶酶活力的測定

在固定化果膠酶中加入2 mL HAc-NaAc緩沖液（pH 3.5），40℃水浴平衡5 min，再加入1 mL預先平衡至40℃的1%的果膠溶液，40℃水浴反應30 min，取出固定化酶，將反應液立即在沸水浴中煮5 min使酶失活，冷卻。從反應液中取2 mL于試管中，用DNS法測定其還原糖含量。酶活力單位定義同自由果膠酶的活力單位[12]。

1.4 單因素試驗

1.4.1 酶濃度對酶活力的影響

配制 0.05%、1%、2%、3%、4%、5%的果膠酶溶液，按照固定化酶的制備方法制備不同濃度的固定化果膠酶。在溫度為40℃，pH 3.5的條件下測其酶活力，并比較自由酶的酶活。

1.4.2 溫度對固定化酶活力的影響

分別在溫度為 25、30、35、40、45、50 ℃，酶濃度為3%，pH 3.5的條件下測定固定化酶和自由酶的酶活。

1.4.3 pH值對酶活力的影響

分別在 pH 值為 2.6、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，溫度為40℃，酶濃度為3%的條件下測定自由酶和固定化酶的活力。

1.4.4 反應時間對酶活力的影響

分別在反應時間為 15、30、45、60、90、120、150 min，溫度為40℃，酶濃度為3%，pH 3.5的條件下測定自由酶和固定化酶的活力。

1.4.5 果膠濃度對酶活力的影響

配制 0.2%、0.5%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%、2.0%濃度的果膠溶液，在溫度為40℃，酶濃度為3%，pH 3.5，反應時間為120 min的條件下測定固定化酶和自由酶的酶活。

2 結果與分析

2.1 固定化酶載體的表征

載體的FT-IR譜圖見圖1。

圖1 PPH-GA的紅外光譜分析圖Fig.1 Infrared spectrum analysis of PPH-GA

由圖1可知，聚苯胺基超分子水凝膠-戊二醛在3 435、1 302 cm-1處有吸收峰，該峰歸因于N-H鍵和C-N 鍵的伸縮振動；1 646、1 557、798 cm-1處的吸收峰歸因于苯環的伸縮振動；在1 403 cm-1的吸收峰歸因于C-H鍵的伸縮振動。1 213 cm-1處的峰歸因于聚乙烯醇（polyvingl alcohol，PVA）分子C-O鍵的伸縮振動。復合材料的官能團特征峰明顯，表明豐富的官能團能較好地鍵合在材料表面。

載體的SEM譜圖見圖2。

圖2 PPH-GA復合材料SEM圖Fig.2 SEM of PPH-GA composite

由圖2可知，PPH-GA復合材料具有三維網狀結構，且孔徑大，有利于酶的固定化。

2.2 固定化果膠酶活力

固定化果膠酶活力見表1。

表1 一定反應條件下自由酶和固定化酶的活性參數Table 1 Activity parameters of free enzyme and fixed enzyme under certain reaction conditions

由表1可知，在最佳反應條件下固定化酶的催化活力是203.4 U/mg。計算出的固定化酶的載酶量為268.1 mg/g。

2.3 不同酶濃度對酶活的影響

不同酶濃度對酶活的影響見圖3。

圖3 不同酶濃度對酶活的影響Fig.3 Effect of different enzyme concentration on enzyme activity

對于純酶來說，一般認為在pH值、反應溫度和反應底物濃度相同時，酶的催化能力與酶的濃度成正比關系。由圖3可知，固定化酶的活力隨酶濃度的增大而提高，但當酶濃度增大到一定程度后，固定化酶的活力開始下降，自由酶亦然，這是由于載體的結合位點有限，酶濃度過大時，造成載體的空間位阻過大，底物與產物不能夠在第一時間分散，使得固定化酶的催化能力降低。因此，固定化酶最佳酶濃度為3%。

2.4 不同溫度對固定化酶活力的影響

不同溫度對酶活的影響見圖4。

圖4 不同溫度對酶活的影響Fig.4 Effect of different temperature on enzyme activity

與一般化學反應一樣，當溫度升高，酶解反應速率會加快，同時酶的活性也會隨之降低。由圖4可知，固定化酶和自由酶的活力都是先增大再減小的。在一定溫度范圍內固定化酶和自由酶的相對酶活增幅較大，說明溫度對酶活性的影響較明顯。固定化酶最佳反應溫度為40℃。

2.5 不同pH值對酶活力的影響

不同pH值對酶活力的影響見圖5。

圖5 pH值對酶活的影響Fig.5 Effect of pH on enzyme activity

酶是一種蛋白質，反應體系的pH值影響酶分子活性部位中催化基團與結合基團的解離狀態，同時也影響著底物的解離狀態，對酶分子的空間結構和專一性也有一定的影響。酶的最適pH值并不是一個常數，只是在一定條件下才有意義。由圖5可知，固定化酶的最佳pH值為3.5，自由酶的最佳pH值為3.0。與自由酶相比較固定化酶的pH值范圍更廣。

2.6 不同反應時間對酶活力的影響

不同反應時間對酶活力的影響見圖6。

由圖6可知，自由酶的最佳反應時間為90 min，固定化酶的最佳反應時間為120 min。反應時間過長，酶活力降低的原因可能是底物被分解為其他物質。

圖6 反應時間對酶活的影響Fig.6 Effect of reaction time on enzyme activity

2.7 不同果膠濃度對酶活力的影響

不同果膠濃度對酶活力的影響見圖7。

圖7 不同果膠濃度對酶活的影響Fig.7 Effect of pectin concentration on enzyme activity

由圖7可知，不同果膠濃度對自由酶和固定化酶的影響不同,固定化酶的酶活力隨著果膠濃度的增大呈增大趨勢，固定化酶最佳果膠濃度為2%。自由酶活力呈先增大后減小的趨勢，自由酶最佳果膠濃度為1.0%。

3 結論

本研究制得了性能較好的PPH-GA復合材料,通過FT-IR發現PPH-GA復合材料的官能團特征峰明顯,材料表面較好地鍵合了豐富的官能團。SEM發現PPH-GA材料具有三維網狀結構，有較大的孔徑，具有良好的固酶特性。經試驗測得固定化酶的載酶量為268.1 mg/g。并且通過單因素試驗得出固定化果膠酶在pH3.5，反應溫度為40℃，酶濃度為3%，反應時間為120 min，果膠濃度為2%時，具有最高活性。固定化果膠酶比自由酶更穩定，并且固定化果膠酶可以回收重復利用，既避免了自由酶易失活，不能長期保存的問題，也在一定程度上降低了成本，為固定化酶的研究提供了理論基礎。