楊昭,梁瑞進,何春蘭,曾琳琦,莫觀連,李曉娜
(1.廣東食品藥品職業學院食品學院,廣東 廣州 510520;2.廣東食品藥品職業學院醫療器械學院,廣東 廣州 510520)
牡蠣屬于軟體動物門,瓣鰓綱,異柱目,牡蠣科,主要品種有近江牡蠣、大連灣牡蠣、褶牡蠣、長牡蠣和密鱗牡蠣等[1]。牡蠣是世界上第一大養殖貝類。作為最古老的水產養殖動物之一,牡蠣養殖遍布全球。在2016年,全球6個牡蠣養殖生產大國分別是中國、法國、美國、韓國、日本和加拿大。目前全球牡蠣養殖生產以中國為主,占全球產量的86%和產值的78%[2]。牡蠣是我國四大養殖經濟貝類之一,養殖區域集中在沿海地區,主要分布在山東、福建、廣東和香港等沿海地區[3]。近十年來,我國牡蠣養殖產量逐年增加,年產量超過400萬噸[4]。牡蠣肉質鮮美,含有豐富的蛋白質(45%~47%)、脂肪酸(7%~11%)、牛磺酸(50.6 mg/g)、總糖(20%~40%)和微量元素(硒、鋅、鈣)等,擁有極高的營養價值,被稱為“海洋牛奶”[5]。鑒于牡蠣具有較大的產量、較高的營養價值和較強的生物活性,研究者圍繞牡蠣資源的精深加工、生物活性物質篩選和品質監測開展了大量的研究工作。揮發性風味成分對產品的感官和品質有重要影響。因此,本文對牡蠣生鮮、貯藏、加工和酶解過程中揮發性風味成分的分離與鑒定進行綜述,以期為牡蠣產品品質提升提供理論基礎,促進牡蠣資源在食品中的應用。
揮發性風味成分是生鮮牡蠣特征性風味的物質基礎。不同品種、產地和養殖區域對生鮮牡蠣揮發性風味成分的影響較大。Josephson等[6]在太平洋牡蠣和大西洋牡蠣中都發現了1-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-醇、1,5-辛二烯-3-酮、1,5-辛二烯-3-醇和 2,5-辛二烯-1-醇。(E,Z)-2,6-壬二烯醛和 3,6-壬二烯-1-醇賦予太平洋牡蠣類似甜瓜香氣,但這些化合物在大西洋牡蠣中沒有被發現。Pennarun等[7]采用真空水蒸氣蒸餾法提取太平洋牡蠣的揮發性風味成分,利用氣相色譜法和嗅覺測定法鑒定出59種揮發性成分,發現3-己烯-1-醇、癸醛、2-十一烷和3,6-壬二烯-1-醇等成分賦予牡蠣新鮮和海洋氣味。目前,頂空固相微萃取結合氣相色譜質譜法(headspace solid phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)是鑒定牡蠣揮發性成分的主要方法。劉輝等[8]采用固相微萃取結合氣相色譜質譜法從渤海產地牡蠣肌肉中鑒定出24種成分,含量比較豐富的化合物為1-庚烯-3-醇、3-辛酮、十二烯醛、葉綠醇、肉豆蔻酸和鄰苯二甲酸二丁酯。由于頂空固相萃取效果受到多種因素的影響,如萃取頭種類、萃取時間和萃取溫度等,因此有必要對萃取條件進行優化,以便獲得更準確的結果[9]。Fratini等[10]系統研究了貝類揮發性成分頂空固相微萃取條件(萃取頭種類、樣品體積、萃取時間和萃取溫度),發現CAR-PDMS萃取頭在80℃下萃取30 min,可以從6 mL鹽水提取物中最有效、最準確地提取揮發性成分,并應用此方法從西班牙地區生鮮牡蠣中鑒定出22種揮發性成分。
牡蠣的生長周期和養殖環境(水質、溫度和鹽度等)對其營養成分和品質有一定的影響,進而對其揮發性風味成分也會造成影響[11]。黃艷球等[12]采用HSSPME-GC-MS從廣西欽州、廣東陽江、廣東湛江和廣東汕頭4個養殖區香港牡蠣中鑒定出108、89、103、91種揮發性風味成分,發現揮發性成分的數量、類型和含量在不同養殖區的牡蠣中存在差異。(E,Z)-2,6-壬二烯醛對廣東陽江、廣西欽州和廣東湛江牡蠣氣味有顯著影響,1-辛烯-3-酮對廣東汕頭牡蠣氣味有顯著影響。林海生等[13]采用HS-SPME-GC-MS系統研究了中國不同海域、不同牡蠣品種的揮發性風味成分,發現醛類是新鮮牡蠣特征氣味的重要組分,各地區牡蠣中檢出的揮發性成分數量和種類有所不同。1-辛烯-3-酮是汕頭牡蠣最關鍵風味物質,而(E,Z)-2,6-壬二烯醛對其它11種牡蠣的風味貢獻最大。Van Houcke等[14]發現不同品種、養殖區和收獲季節對牡蠣揮發性成分都有重要的影響。品種間揮發性成分的差異主要是由1,5-辛二烯-3-醇和3-環己烯-1-乙醇引起的。養殖區間揮發性成分的差異主要是由1-戊烯-3-酮、正己烷和丁香醛引起的。一月和二月收獲季節揮發性成分的差異主要是由1-戊烯-3-醇、(E,Z)-2,6-非二烯醛和庚醛引起的。歐洲扁牡蠣主要揮發性成分為3-環己烯-1-乙醇,太平洋牡蠣主要揮發性成分為1,5-辛二烯-3-醇。
牡蠣不同部位呈現不同的感官特征,所含的揮發性風味成分必然不同。劉琳琳[15]采HS-SPME-GC-MS從香港牡蠣外套膜、肝胰腺和胴體中分別鑒定出27、30、27種揮發性成分,發現(E,E)-2,4-癸二烯醛、(E,Z)-2,6-壬二烯醛、(E)-2-癸烯醛、(E)-2-辛烯醛、十二醛、正辛醛、(Z,Z)-3,6-壬二烯醛、(E)-2-壬烯醛和1-辛烯-3-醇等9種成分對牡蠣愉快風味有貢獻,而(E,E)-2,4-壬二烯醛和二甲基硫醚是牡蠣腥味的主要成分。(E,E)-2,4-壬二烯和二甲基硫醚分別對胴體和外套膜的腥味有重要影響。
綜上可知,研究者已對不同品種、產地、養殖區域、收獲季節和部位生鮮牡蠣的揮發性風味成分進行了系統的研究,但揮發性風味成分的提取方式、提取條件和定性方法對結果的準確性及鑒定得到的揮發風味成分數量和成分有重要影響,詳見表1。因此后續研究牡蠣揮發性風味成分需要關注這些試驗條件。

表1 生鮮牡蠣揮發性風味成分Table 1 Volatile flavor components of raw oyster
牡蠣在貯藏過程中,會發生一系列的生化反應,揮發性風味成分也相應地發生改變。揮發性風味成分可以作為監測牡蠣新鮮度的指標。Kawabe等[17]采用電子鼻和HS-SPME-GC-MS研究了帶殼牡蠣在5℃和20℃空氣暴露貯藏7 d后揮發性成分的變化,發現牡蠣氣味在貯藏期間惡化。三甲胺和揮發性羧酸可以作為監測牡蠣貯藏條件(溫度和時間)和判定新鮮度的指標。張智翠等[18]采用HS-SPME-GC-MS對新鮮牡蠣與-20℃下凍藏3、6、9、12個月的太平洋牡蠣揮發性成分進行了鑒定,發現凍藏過程中,牡蠣揮發性成分發生了較大的變化。硫磺味、油脂味和刺激的青草味成分在儲藏過程中增加,而新鮮植物、蘑菇、柑橘和藥草等新鮮芳香風味成分有所下降。凍藏牡蠣需經解凍后才能食用,室溫解凍是常用的方式,然而解凍過程中有可能發生腐敗、蛋白質分解等反應。沈麗等[19]發現隨著解凍時間的延長,牡蠣揮發性成分中醛類和酮類化合物相對含量減少,胺類化合物及其它化合物相對含量增加。頂空固相微萃取和水蒸氣蒸餾法分別適用于低沸點和高沸點揮發物的萃取。因此,為準確監測牡蠣貯藏期間揮發成分的變化,將頂空固相微萃取與水蒸氣蒸餾法聯用可以獲得更多種類的牡蠣揮發性成分。Zhang等[9]采用HS-SPME-GC-MS從新鮮牡蠣和變質牡蠣中分別鑒定出20、27種揮發性成分,同時用水蒸氣蒸餾結合氣相色譜質譜法從新鮮牡蠣中鑒定出16種揮發性成分。
熱處理是牡蠣加工的重要方法,經過熱加工處理,產品的風味會發生一系列的變化。顧聆琳等[20]從生牡蠣和煮制牡蠣中分別鑒定出34種和36種化合物。劉琳琳等[21]從鮮牡蠣和熟制牡蠣中分別鑒定出101種和107種揮發性風味成分。經過熱處理,對風味影響比較大的醛類、酸類和酯類化合物數量均增多。加熱溫度對牡蠣揮發性風味影響較大。黃健等[22]運用電子鼻和 HS-SPME-GC-MS 對 40、60、80、100、120、150 ℃溫度下加熱30 min的牡蠣揮發性成分進行分析,發現電子鼻能夠靈敏地檢測到牡蠣在加熱過程中氣味的變化。新鮮牡蠣在加熱到100℃和150℃時氣味發生明顯變化。從新鮮牡蠣、100℃加熱牡蠣和150℃加熱牡蠣中分別檢出47、59、56種揮發性成分。經過100℃加熱后,牡蠣的腥味減弱,肉香濃郁,醛類和雜環化合物是其主要的揮發性風味成分。150℃加熱牡蠣的主要揮發性成分是烴類化合物,雜環類化合物對其烘烤風味的形成具有重要作用。劉亞等[23]采用電子鼻、電子舌分析了水煮20、40、80、120 min牡蠣煮制液的氣味及滋味特征的差異,發現80 min樣品在氣味和滋味方面均表現出明顯的差異,且煮制80 min的牡蠣煮制液風味最好。不同養殖區域的牡蠣樣品,經過相同條件熱處理后,依然表現出揮發性風味成分的差異。海南島東北部、西北部和北部3個區域養殖牡蠣,經蒸煮5 min 后,分別檢出 65、57、57 種揮發性成分[24]。牡蠣在熱處理過程中,許多香味成分在烹調過程中消失了,而這些加工過程中損失的香味成分可能具有一定的應用價值。Soares等[16]采用HS-SPME-GC-MS系統研究了萃取頭種類、萃取時間、萃取溫度和解吸時間等因素對牡蠣不同熱加工階段揮發性成分的影響,獲得最佳萃取條件為PDMS/CAR萃取頭在80℃條件下萃取30 min,然后解吸30 min。從牡蠣烹調汁和蒸汽中鑒定出豐富的揮發性有機化合物,主要為烴類、醇類、醛類、酮類和酯類化合物。盡管研究者對不同熱處理方式牡蠣的揮發性成分進行了較多的研究,但主要研究結果呈現在成分的種類和含量的差異,未明確熱處理后揮發性成分的變化規律或機理。
牡蠣體液是新鮮牡蠣去除殼和肉后的液體,其可以作為調味汁的原料。劉文等[25]從新鮮、100℃處理和150℃處理的牡蠣體液中分別鑒定出42、29、23種揮發性成分。100℃處理牡蠣體液具有濃郁的花香味、果香味、肉香味和焦香味,酮類和呋喃類是其主要的揮發性成分。150℃處理牡蠣體液具有濃郁的焦香和甜香,酯類和雜環化合物是其主要的揮發性成分。
生鮮牡蠣營養豐富、含水量高、不易貯藏。在生產、運輸和銷售過程中,極易受到微生物、溫度等眾多外部環境不利因素的影響,極易造成產品感官品質和營養成分的劣變,甚至導致腐敗變質,失去食用價值。牡蠣經過干制后,耐貯藏,便于運輸和銷售,但干制后牡蠣的風味發生了變化。孟維博等[26]發現不同干燥方式對牡蠣感官影響顯著,電子鼻能較好區分不同干燥方式牡蠣干的氣味,熱風微波聯合干燥是牡蠣干制較佳的方法。吳群芳等[27]以僧帽牡蠣為原料,采用熱風干燥制備牡蠣干。利用同時蒸餾萃取-氣質聯用法從貯藏初期、中期和后期的牡蠣干樣品中鑒定出38、35、30種揮發性風味成分,發現貯藏初期牡蠣干具有怡人的貝類肉的甜香味,而貯藏后期牡蠣干具有不愉快的酸味和脂肪氧化氣味。
超高壓技術能在常溫或低溫下殺死微生物,且能較大程度保持食品固有的色澤、風味和口感,已在牡蠣貯藏和加工中進行應用[28]。不同壓力處理對牡蠣肉中揮發性成分的影響較大。Cruz-Romero等[29]研究了260、500、800 MPa 高壓處理 3、5、5 min 后牡蠣的揮發性成分變化,發現超高壓處理改變了牡蠣揮發性成分的水平。與未處理樣品相比,超高壓處理樣品的二甲基硫、1-戊烯-3-酮、苯酚和1,2,4-三甲基苯濃度更高。王曉謙等[30]采用HS-SPME-GC-MS從200、400、600 MPa處理牡蠣肉中分別檢測到54、57、62種成分。超高壓技術是一種具有良好應用前景的非熱加工技術,目前其對牡蠣加工及揮發性成分影響的研究較少,值得進一步研究。
牡蠣肉具有腥味,在加工處理過程中,部分研究者報道了牡蠣肉脫腥的方法。李龍飛等[31]采用熱燙和真空脫腥相結合的方法對香港牡蠣肉進行脫腥試驗,發現在溫度為80℃,時間3 min,真空度為0.07 MPa的條件下進行脫腥處理,牡蠣肉中的腥味物質總數由脫腥前的12種降至10種,相對含量由19.18%降至15.19%,腥味脫除率達到了20.8%,能夠較好地脫除牡蠣肉的腥味。真空脫腥的工業化應用成本較高且較難規模化應用,采用天然提取物進行脫腥可能是一種比較好的脫腥方式[32]。
牡蠣肉水提液中含有蛋白質、糖原和牛磺酸等營養成分,可以用作飲料加工。然而牡蠣肉提取液含有腥味。王丹[33]發現添加0.75%的活性炭,在60℃條件下處理20 min為牡蠣水提液最佳的脫腥工藝。活性炭脫腥后,牡蠣水提液的腥味減弱,且其中的醛類、酮類和醇類化合物相對含量增加。這些揮發性成分的變化使得牡蠣水提液的腥味降低,并具有牡蠣特有的清香。
大量研究報道牡蠣酶解產物具有在抗氧化、降血糖和抗腫瘤等多種生理活性[34]。牡蠣酶解液的風味對其應用具有重要影響。研究表明牡蠣酶解液隨水解時間的延長,腥味變重,風味變差[35-36]。劉曉麗等[37]采用固相微萃取-氣相色譜質譜聯用法從新鮮近江牡蠣、木瓜蛋白酶酶解液和中性蛋白酶酶解液中分別鑒定出57、60、62 種成分,主要有烴類、醇類、醛類、酮類和含硫化合物等。其中新鮮牡蠣含有較多的酮類化合物,而酶解液中則含有較多的醛類和脂類化合物。中性蛋白酶制備的酶解液比木瓜蛋白酶制備的酶解液風味更加柔和。鄧嫣容[38]采用溶劑萃取直接進樣,經氣相色譜-質譜法從優化后的復合蛋白酶牡蠣酶解液中鑒定出20種化合物,主要成分為乙酸異丁酯、2,5-二甲基吡嗪、3-甲硫基-丙酸甲酯、3-乙基-2,5-甲基吡嗪、糠醇、愈創木酚、棕櫚酸和肉豆蔻酸。蘇明月等[39]采用電子鼻和HS-SPME-GC-MS對堿性蛋白酶酶解牡蠣過程中揮發性風味成分進行分析,在0、1、3 h牡蠣酶解液中分別鑒定出31、32、36種揮發性風味物質。Kim等[40]采用蛋白酶對牡蠣罐頭加工廢水進行酶解,期望加工成海鮮調味劑,利用真空同步蒸汽蒸餾-溶劑萃取揮發性成分,鑒定出15種揮發性成分,主要的揮發性風味成分是2-乙酰-1-吡咯烷和3-(甲基硫氧)丙醛。戴梓茹等[41]采用HS-SPME-GC-MS從牡蠣多肽中鑒定出40種揮發性成分,主要以酯類、醛類、酮類和醇類為主,其中含量較高的主要揮發性成分為2,5-雙(三甲基硅氧基)苯甲醛、2,2,4-三甲基戊二醇丁酯和鄰苯二甲酸二異丁酯。
綜上可知,蛋白酶種類和酶解時間對牡蠣酶解液揮發性成分的影響較大。因此,為獲得風味品質較佳的牡蠣酶解液,應系統評估牡蠣酶解過程中不同蛋白酶和水解條件等影響因素。
牡蠣經過酶解后,其本身所具有的腥味以及酶解過程中產生的異味嚴重影響了牡蠣酶解液的應用。腥味和異味是牡蠣酶解液主要的不良風味。從形成機理分析,主要可能有以下3個方面的原因:(1)多不飽和脂肪酸在脂肪氧合酶的作用產生醛類、酮類揮發性成分;(2)游離脂肪酸的自動氧化分解;(3)牡蠣因吸附和攝食等途徑富集腥味成分。劉琳琳[15]詳細分析了牡蠣酶解過程中風味劣變的原因,發現牡蠣酶解過程中脂質發生了氧化,其中以不飽和脂肪酸氧化為主。單不飽和脂肪酸(芥酸、花生一烯酸和油酸)和多不飽和脂肪酸(二十二碳二烯酸、花生四烯酸、亞麻酸、亞油酸和花生二烯酸)含量均不同程度降低。同時發現脂質氧化從開始酶解前的打漿、調配料液比等階段已經發生。因此,建議從減少醛類等不良風味的含量或者抑制脂肪氧化兩個方面開展酶解液脫腥研究。
目前牡蠣脫腥的方法主要有物理脫腥(真空、活性炭吸附、包埋)、化學脫腥(姜汁、茶多酚、美拉德反應)和生物脫腥(酵母發酵)。葉盛權等[42]采用感官評價法比較了活性炭吸附法、β-環狀糊精包埋法和酵母發酵法對牡蠣酶解液脫腥效果,發現活性炭吸附法的脫腥效果最好,最佳條件為添加0.5%的活性炭,在30℃、pH7.0的條件下吸附0.5 h。脫腥后酶解液基本無腥味,蛋白質回收率為84.65%。然而活性炭吸附法會損失部分營養成分。在牡蠣酶解過程中添加姜汁,也具有較好的去腥效果。添加姜汁后,脂肪氧化產生的(Z)-4-庚烯醛、壬醛、(E)-2-戊烯醛和2,3-辛二酮等不愉快成分未被檢測到,己醛、異戊醛和(E)-2-己烯醛的相對含量分別減少了81.02%、33.28%和54.39%[43]。劉琳琳[15]發現牡蠣酶解液腥味很重,真空脫腥后酶解液腥味一般,茶多酚脫腥后酶解液幾乎無腥味。茶多酚脫腥效果顯著。從酶解液、真空脫腥酶解液和茶多酚脫腥酶解液分別檢測出38、24、22種揮發性成分,而其中的氣味活性化合物分別為11、9、1種。
盡管研究報道姜汁和茶多酚對牡蠣酶解液的脫腥效果較好,但考慮其添加會引入額外的風味成分,可能不適合脫腥后牡蠣酶解液在飲料中的應用。張梅超[44]在牡蠣酶解液中添加0.2%的釀酒酵母,37℃條件下,發酵30 min。發現酵母處理后的牡蠣酶解液感官風味較好,基本無腥味,呈現出濃郁的果香和花香。經過HS-SPME-GC-MS分析,脂質氧化產生的2-壬烯醛、異戊醛等醛類物質未被檢測到,而2,3-丁二酮、辛酸乙酯和香葉醇等愉快風味成分相對含量分別增加6.01%、0.42%和1.09%。
相對于單因素脫腥方法,聯合脫腥法(酵母發酵結合活性炭處理)不僅能提高蛋白回收率,還能有效去除牡蠣腥味成分,并增加愉快風味成分的比例。劉慧等[45]從脫腥前的牡蠣酶解液中共檢出44種揮發性化合物,其中呈愉快氣味的化合物30種,呈不愉快氣味的化合物有14種。從脫腥后的牡蠣酶解液中共檢出47種化合物,其中愉快氣味的化合物增加至39種,而不愉快氣味的化合物減少至8種。脫腥后牡蠣酶解液中不愉快氣味化合物的濃度下降了67.66%,而愉快氣味化合物的濃度提高7.93%。劉艷[46]同樣發現聯合脫腥法更能有效去除牡蠣酶解液的腥味,具體做法為牡蠣酶解液添加1.0%的活性干酵母,在40℃下處理45 min后,濾液用12%珍珠巖在50℃下處理40 min。經氣相色譜質譜法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)檢測發現脫腥后酶解液中的醛類、胺類和酸類物質相對含量明顯降低,醛類化合物相對含量從31.48%降到13.21%。
傳統的物理吸附、酵母脫腥和天然物質的添加,主要的脫腥作用在于吸附腥味成分、添加新的風味成分、掩蓋腥味成分或者抑制酶解過程中不良風味的形成,對牡蠣酶解液的生理活性幾乎無有益的影響。美拉德反應不僅能夠明顯改善牡蠣酶解液的風味,還能對其生理活性有強化的作用,所制備的酶解產物具有較好的應用前景[47]。高加龍等[48]采用美拉德反應對牡蠣酶解液進行脫腥處理。從美拉德反應前后的牡蠣酶解液中分別檢出了41種和40種揮發性成分。經美拉德反應后,牡蠣酶解液中的醛類、酮類和酯類明顯減少,而醇類物質則明顯增加。袁林等[49]從優化的牡蠣酶解液美拉德反應產物中鑒定出45種揮發性成分,發現經過美拉德反應后,牡蠣酶解液的主要揮發性成分變為二甲基三硫醚、二甲基二硫醚和(Z)-4-庚烯醛等,賦予反應產物貝香味、肉香味和海鮮味。同時,美拉德反應產生的吡嗪類物質,賦予了部分堅果-肉香味。張滿等[50]同樣發現經正交優化的牡蠣酶解液美拉德反應產物,具有最佳的感官風味,無腥味,且具有良好的肉香味。
目前,生鮮牡蠣揮發性風味成分的研究已經非常成熟,已明確不同品種、產地和養殖區域牡蠣的揮發性成分存在差異。牡蠣在貯藏、加工和酶解等處理過程中揮發性成分的變化也有了較為充分的研究。牡蠣酶解液具有多種生理活性和廣泛的應用,對其進行品質提升具有重要意義。雖然已有牡蠣酶解液脫腥的研究報道,但仍然不能較好地解決腥味、異味和風味淡等品質問題。因此在后續研究中,可以針對以下研究方向進行深入研究:(1)目前牡蠣揮發性風味成分的分離與鑒定主要采用的是HS-SPME-GC-MS,可以引入氣相色譜-離子遷移光譜、全二維氣相色譜與飛行時間質譜聯用等新技術來提高檢測的便利性和準確性;(2)牡蠣酶解是一個復雜的過程,同時對酶解液的風味有眾多影響因素,包括牡蠣前處理方式、蛋白酶的選擇、水解度的控制和水解過程中脂質氧化的抑制等;(3)酵母脫腥法具有操作簡便、條件溫和、適宜大規模生產和安全性高等優點。目前酵母脫腥法在牡蠣酶解液脫腥中的研究不太充分。可深入探究酵母種類及活性成分對酶解液腥味成分脫除的影響。例如,酵母葡聚糖在去腥中的應用;(4)美拉德反應是酶解液脫腥增香的重要方法之一。目前已有牡蠣酶解液美拉德反應研究報道,但美拉德反應影響因素較多,反應過程較為復雜,值得深入研究。此外,在牡蠣酶解液制備和腥味脫除過程中,不僅要考慮風味成分的變化,還需考慮酶解液營養成分、功能特性和生理活性的變化。