柚子皮多糖體外消化抗氧化活性的變化規律

萬劉靜，張利

（1.重慶工貿職業技術學院生物化學工程系，重慶 408000；2.四川輕化工大學化學工程學院，四川 自貢 643002）

柚子是蕓香科喬木，具有清腸、助消化、利便、潤肺、健脾胃、補血的功效，也可促進傷口愈合，對敗血癥有良好的療效[1]。柚子在世界各地均有種植，我國柚子總產量可達300萬噸，柚子皮約占柚子總量的40%[2]，經食用后柚子皮因得不到充分利用造成了嚴重的資源浪費。據研究報道柚子皮中活性物質如多糖、膳食纖維、果膠、黃酮、香精油類等均具有多種生理活性[3]，但柚子皮的深加工還待進一步擴大。

柚子皮多糖是柚子皮主要成分之一，具有抗炎癥、抗氧化、增強機體免疫力、預防腫瘤、抗病毒、調節機體血糖血脂等功效[4-5]。目前對柚子皮多糖的研究僅在提取方面，多糖提取方法主要有溶劑提取、酶法、超聲波輔助提取、化學法等[6-8]。其中超聲輔助提取法具有節時、節能且綠色安全等優點，酶法具有安全性高、產品質量及純度較高、反應條件溫和但成本高等特點。王瑩等[9]以柚皮為原料，利用纖維素酶與果膠酶輔助提取柚子皮多糖，結果表明在提取時間80 min、酶用量2.0%、提取溫度60℃、pH值為4.0的最佳工藝條件下柚子皮中多糖得率為8.26%，江飛鳳等[8]采用超聲-微波協同提取柚子皮多糖，在液料比39∶1（mL/g），微波功率400 W，提取液pH 9.0，提取時間34 min的條件下制備得到的多糖得率為10.41%，張荔菲等[2]采用超聲輔助酶法，在加酶量1.73%、酶解時間1.19 h和超聲時間29.17 min的單因素試驗基礎上采用響應面優化試驗制備得到的柚子皮多糖的平均提取率為82.4%，得率為27.3%。但關于柚子皮多糖模擬體外消化的研究鮮有報道。

模擬體外消化模型是通過模擬胃腸消化后食物的消化特性，已經成為體外模擬人體消化吸收的有效途徑和最新趨勢[10-11]。目前，有關柚子皮多糖在體外消化模型中的抗氧化活性評價鮮有報道，因此本研究采用超聲波輔助提取技術，通過對超聲溫度、超聲時間、復合酶添加量以及酶解時間為單因素，采用正交試驗對結果進行優化分析，將最佳條件下制備得到的柚子多糖進行體外模擬唾液、胃液以及小腸液消化試驗，全面地評價柚子皮多糖在消化過程中的抗氧化活性變化情況，以期為柚子皮多糖的營養健康產品的研發和工業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙田柚：市售，將其切成小塊進行凍干，之后用粉碎機粉碎，過80目篩，取篩下物密封備用。胃蛋白酶（豬源，3 000 U/mg）、胰酶（豬胰腺，4 000 U/mg）、纖維素酶（400 U/mg）、果膠酶（500 U/mg）：阿拉丁試劑有限公司；鄰菲羅啉、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）：上海源葉生物科技有限公司；磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵、鄰苯三酚、無水乙醇、鹽酸、H2O2、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉：西隴化工股份有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

XA-1高速粉碎機：上海燁昌食品機械有限公司；EL204電子天平：梅特勒托利多儀器有限公司；HH-2恒溫水浴鍋：國華（常州）儀器制造有限公司；RE52CS旋轉蒸發儀：上海耀特儀器設備有限公司；TGL-16GB高速離心機：上海安亭高速臺式離心機。

1.3 方法

柚子皮預處理（凍干后粉碎過80目，取篩下物）→超聲處理→離心（6 500 r/min離心8min）→濃縮→醇沉（4倍體積的無水乙醇進行醇沉過夜）→取醇沉物凍干后稱重即為柚子皮多糖質量。

1.4 柚子皮多糖得率測定

式中：m1為柚子皮多糖的干重，g；m為柚子皮干重，g。

1.5 基本營養成分分析

蛋白質測定：GB/T 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》；脂肪測定：GB/T5009.9—2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》；灰分測定：GB/T 5009.4—2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》；水分測定：GB/T 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》；膳食纖維測定：GB/T 5009.88—2014《食品安全國家標準食品中膳食纖維的測定》。

1.6 超聲輔助酶法提取柚子皮多糖單因素試驗

準確稱取2 g柚子皮粉，分別設置超聲溫度（20、30、40、50、60℃）、超聲時間（20、30、40、50、60 min）、復合酶添加量（纖維素酶∶果膠酶質量比為1∶1）（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%）、酶解時間（20、30、40、50、60 min），考察超聲溫度、超聲時間、復合酶添加量、酶解時間對柚子皮多糖得率的影響。

1.7 正交試驗設計

在單因素的基礎上，設計四因素三水平的正交試驗優化提取工藝，試驗自變量與水平見表1。

表1 試驗自變量與水平Table 1 Codes and levels factors chosen for experiment

1.8 體外模擬胃腸液抗氧化活性研究

1.8.1 體外模擬消化液的收集與配制

1.8.1.1 唾液收集

漱口后，將初始唾液舍棄后開始進行收集，收集周期為30 s，直至收集夠試驗需求量，將收集到的唾液于6 000 r/min轉速下離心處理20 min，取上清液于-20℃保存。

1.8.1.2 模擬胃液的配制

準確稱取10 g胃蛋白酶，加少量蒸餾水將其溶解后加入16.4 mL鹽酸并定容至1 000 mL，1 mol/L磷酸緩沖液調pH值至1.3后放置在4℃冰箱中保存。

1.8.1.3 模擬腸液的配制

準確稱取6.8 g磷酸二氫鉀加少量蒸餾水將其溶解后用4%NaOH溶液并定容至1 000 mL，1 mol/L磷酸緩沖液調pH值至7.0；另準確稱取10 g胰酶用100 mL蒸餾水將其充分溶解；兩液混合后加蒸餾水定容至1 000 mL后放置在4℃冰箱中保存備用。

1.8.2 體外模擬消化系統方法

1.8.2.1 模擬口腔的消化

準確吸取2 mL唾液和2 mL待測液（4.0 mg/mL）于6支試管中，封口混勻，于37℃恒溫水浴鍋中進行消化試驗，分別取消化 5、10、15、 20、30、60 min 后的消化液于沸水浴中滅酶10 min，冷卻至室溫（25℃）后于4 000 r/min離心10 min，取上清液于-20℃保存備用[12]。

1.8.2.2 模擬胃液的消化

樣品溶液經唾液消化15 min后分別加入預熱模擬胃液 4 mL，用1 mol/L NaHCO3調pH值至7.0，封口混勻，于37℃恒溫水浴鍋中進行消化試驗，分別消化5、10、15、60、120、240 min 后于沸水浴中滅酶 10 min，冷卻至室溫（25℃）于4000r/min離心10min，取上清液于-20℃保存備用[12]。

1.8.2.3 模擬腸液的消化

將模擬胃液消化后消化液調pH值至5.5后加入預熱的模擬腸液（反應液與腸液體積比為10∶3），封口混勻于37℃恒溫水浴鍋中進行消化試驗，分別消化5、20、60、120、240、480 min 后于沸水浴中滅酶 10 min，冷卻至室溫（25℃）于4 000 r/min離心10 min，取上清液于-20℃保存備用[12]。

1.8.3 體外模擬消化液的抗氧化活性研究

1.8.3.1 DPPH·清除率測定

準確吸取 1mL 不同質量濃度的（0、0.1、0.2、0.25、0.5、1、2 mg/mL）待測液、加入 3 mL DPPH-無水乙醇溶液（0.2 mmol/L），混勻后于暗處反應30 min，反應結束后于517 nm處測吸光度值[13]。

DPPH·清除率見公式（2）。

式中：A1為樣品的吸光值；A為空白對照（蒸餾水）吸光值。

1.8.3.2 ·OH清除率測定

準確吸取1 mL待測液，依次加入H2O2（0.5 mL，20 mmol/L）、鄰菲羅啉（1.0 mL，2.5 mmol/L）、硫酸亞鐵（1.0 mL，2.5 mmol/L），調 pH 值為 7.0，室溫（25℃）靜置1h后于536nm處測吸光值[14]。·OH清除率公式如下。

式中：A2為樣品組吸光度值；A1為對照組吸光度值；A0為空白組（蒸餾水）的吸光度值。

1.8.3.3 O2-·清除率測定

準確吸取4.5 mL Tris-HCl緩沖溶液（50 mmol/L，pH 8.2）于試管中，置于25℃水浴中保持20 min，加0.4 mL待測液和0.08 mL鄰苯三酚（25 mmol/L，用10 mmol/L HCl配制），封口混勻后于325 nm波長處測定吸光值，之后每隔0.5 min記錄1次，共記錄4 min。10 mmol/L HCl代替鄰苯三酚溶液，蒸餾水代替樣液作為自氧化管[15]。 O2-·清除率見公式（4）、（5）。

式中：D1為樣品4 min記錄的吸光度值；D2為樣品0 min記錄的吸光度值；T=4 min；V1為自氧化管氧化速率，ΔA/min；V2為樣品管氧化速率，ΔA/min。

1.9 統計學分析

所有試驗均重復3次，用SPSS11.5統計軟件進行方差分析，結果用平均值（±s）表示，采用 Origin Pro 9.0對試驗數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 超聲輔助酶法提取柚子皮多糖單因素試驗

2.1.1 超聲溫度對柚子皮多糖得率的影響

超聲溫度對柚子皮多糖得率的影響見圖1。

圖1 超聲溫度對柚子皮多糖得率的影響Fig.1 The effect of ultrasonic temperature on the yield of polysaccharides in grapefruit peel

柚子皮多糖得率隨著超聲溫度的升高而逐漸增加，當超聲溫度為40℃時柚子皮多糖得率最高可達（24.44±0.53）%，這是因為適當的超聲溫度增大了超聲波的空化效應，有利于多糖的溶出；繼續升高超聲溫度多糖得率略有下降，這可能由于過高的超聲溫度會破壞柚子皮多糖的分子結構，多糖發生輕度水解，同時增加了溶液的黏稠度，不利于多糖的溶出，從而導致多糖得率下降[16-17]。因此，超聲溫度宜選擇為40℃。

2.1.2 超聲時間對柚子皮多糖得率的影響

超聲時間對柚子皮多糖得率的影響見圖2。

圖2 超聲時間對柚子皮多糖得率的影響Fig.2 The effect of ultrasound time on the yield of grapefruit peel polysaccharides

當超聲時間在20 min～40 min時柚子皮多糖得率逐漸增加，且在超聲時間為40 min時多糖得率最高為（25.43±0.59）%，繼續延長超聲時間柚子皮多糖得率無明顯變化且有略微下降，這可能是由于在超聲時間為40min時，使柚子皮中的多糖溶出最多，隨著超聲時間的延長導致柚子皮多糖得率逐漸降低，可能是因為柚子皮多糖已以最高含量溶出，繼續延長超聲時間至60 min，柚子皮多糖細胞結構破壞，多糖發生降解，且溶劑中的其他物質溶出過多使得多糖的溶出空間下降[18]。因此，從節能角度超聲時間宜選擇為40 min。

2.1.3 復合酶添加量對柚子皮多糖得率的影響

復合酶添加量對柚子皮多糖得率的影響見圖3。

圖3 復合酶添加量對柚子皮多糖得率的影響Fig.3 The effect of compound enzyme addition amount on the yield of grapefruit peel polysaccharide

當復合酶添加量為0.5%～1.5%時柚子皮多糖得率逐漸增加，復合酶添加量為1.5%時柚子皮多糖得率達到最高為（24.87±0.36）%，這可能是因為纖維素酶和果膠酶可使柚子皮中纖維素和果膠得細胞結構破壞，從而使柚子皮中的可溶性多糖溶出[2]；繼續增加酶比例，柚子皮多糖得率開始下降。這可能是因為柚子皮多糖發生水解，生成了小分子的多糖、低聚糖或單糖，乙醇無法醇沉下來，從而使得可溶性膳食纖維得率下降[15]。因此復合酶添加量宜選擇為1.5%。

2.1.4 酶解時間對柚子皮多糖得率的影響

酶解時間對柚子皮多糖得率的影響見圖4。

圖4 酶解時間對柚子皮多糖得率的影響Fig.4 The effect of enzymolysis time on the yield of grapefruit peel polysaccharides

隨著酶解時間的增加，柚子皮多糖的得率呈先上升后下降趨勢，當酶解時間達到50 min時柚子皮多糖得率最高可達（25.77±0.89）%。這可能是因為酶的作用導致多糖分子鏈變短，使得更多的可溶性柚子皮多糖溶出，繼續延長酶解時間，柚子皮多糖的得率降低是因為酶解時間過高會使得多糖分子結構被破壞，多糖發生降解，且柚子皮多糖具有溶脹性，溶劑增加導致膠質增大，同時增加溶劑黏度導致得率下降[19]。因此酶解時間宜選擇為50 min。

2.2 正交試驗優化柚子皮多糖提取工藝

采用L9（34）正交表對柚子皮多糖得率進行優化，其因素水平和分析結果與綜合指標見表2。

由表2可知，主次因素順序為C＞A＞B＞D，超聲輔助酶法提取柚子皮多糖的最佳工藝條件A1B2C2D2，即超聲溫度為30℃，超聲時間為40 min，復合酶添加量為1.5%，酶解時間為50 min，在最佳優化條件下驗證得出柚子皮多糖得率為（27.21±0.51）%，均高于其他工藝條件下各指標值。

表2 正交試驗設計與結果Table 2 Orthogonal experimental design and results

2.3 模擬體外消化產物的抗氧化活性變化

2.3.1 體外模擬口腔唾液消化過程中柚子皮多糖消化液的抗氧化活性變化

柚子皮多糖模擬口腔唾液消化過程中DPPH·、·OH和O2-·清除率的變化見圖5。

圖5 模擬口腔唾液消化過程中DPPH·、·OH和O2-·清除率變化規律Fig.5 Changes of DPPH·，·OH and O2-·scavenging ability during the digestion process of simulated oral saliva

由圖5可知柚子皮多糖模擬體外口腔唾液消化產物具有DPPH·、·OH和O2-·清除能力。在模擬消化5min時柚子皮多糖消化液的DPPH·、·OH和O2-·清除率分別為（30.2±2.10）%、（50.7±1.12）%和（13.45±2.41）%。隨著消化時間的延長，DPPH·清除率和·OH清除率呈先上升后下降趨勢，在唾液消化20 min時，DPPH·、·OH和O2-·清除率分別達到最大為（58.65±2.67）%、（76.12±2.31）%和（16.73±2.20）%，推測原因可能與唾液里的消化酶作用時間有關，這與姚思雯等[10]的研究結果一致。但DPPH·清除率達到最高清除能力時低于1 mg/mL的VC溶液，·OH清除率低于3 mg/mL的VC溶液，O2-·清除率達到最高清除能力時遠低于0.1 mg/mL的VC溶液。

2.3.2 體外模擬胃液消化過程中柚子皮多糖消化液的抗氧化活性變化

柚子皮多糖模擬胃液消化過程中DPPH·、·OH和O2-·清除率的變化見圖6。

圖6 模擬胃液消化過程中DPPH·、·OH和O2-·清除率變化規律Fig.6 Changes of DPPH·、·OH and O2-·scavenging ability during simulated gastric juice digestion

圖6表明柚子皮多糖在模擬胃液中的消化產物具有DPPH·、·OH和O2-·清除能力。體外模擬胃液消化5 min時柚子皮多糖消化液的DPPH·、·OH和O2-·和清除率分別為（45.23±2.20）%、（51.17±3.02）%和（20.12±2.02）%。DPPH·清除率隨著消化時間的延長先上升后下降，在模擬消化2h時達到最大清除率為（70.16±2.26）%。繼續延長消化時間，DPPH·清除率下降，這可能是因為柚子皮多糖消化后其結構和化學性質發生了變化[10]。·OH清除率在消化1 h時間內變化不大，在消化1 h時，清除率最大為（58.34±2.45）%。O2-·清除率在胃液消化1 h時清除率達到最大為（32.12±1.78）%。但DPPH·達到最高清除能力時低于2 mg/mL的VC溶液，·OH達到最高清除能力低于化2 mg/mL的VC溶液，O2-·達到最高清除能力遠低于化0.1 mg/mL的VC溶液。

2.3.3 體外模擬腸液消化過程中柚子皮多糖消化液的抗氧化活性變化

柚子皮多糖模擬腸液消化過程中DPPH·、·OH和O2-·清除率的變化見圖7。

圖7表明柚子皮多糖在模擬腸液中的消化產物具有·OH、O2-·和DPPH·清除能力。體外模擬腸液消化5 min時柚子皮多糖消化液的DPPH·、·OH和O2-·清除率分別為（34.3±2.31）%、（37.6±2.22）%和（38.72±2.25）%。在小腸消化8 h時，DPPH·清除率達到最大為（47.22±2.27）%，·OH清除率在模擬消化6 h時達到最大清除率（68.50±2.20）%，繼續延長消化時間，·OH 清除率下降，這可能是因為在模擬腸液消化過程中，柚子皮多糖消化液可能收到了消化酶或者溫度等因素的影響，使得結構和性質發生了改變，從而引起了活性的變化[10]。O2·-清除率在小腸消化4 h時，清除率達到最大為（53.80±2.15）%。但DPPH·達到最高清除能力遠低于0.1 mg/mL的VC溶液，·OH達到最高清除能力低于2 mg/mL的VC溶液，O2·-達到最高清除能力遠低于0.1 mg/mL的VC溶液。VC溶液DPPH·、·OH和O2-·清除率見表 3。

圖7 模擬腸液消化過程中DPPH·、·OH和O2-·清除率變化規律Fig.7 Changes of DPPH·，·OH and O2-·clearing ability during the digestion of simulated intestinal juice

表3 VC溶液 DPPH·、·OH 和 O2-·清除率Table 3 The ability of VCsolution to remove DPPH·，·OH and O2-·radicals

3 結論

采用超聲輔助酶法提取柚子皮多糖，在單因素試驗基礎上利用正交試驗進行分析優化，獲得的最佳工藝參數為：超聲溫度30℃、超聲時間40 min、復合酶添加量為1.5%、酶解時間50 min，在此條件下多糖得率為（27.21±0.51）%，在此條件下柚子皮多糖純度為68.12%，由體外模擬消化抗氧化試驗可知柚子皮多糖消化產物均具有DPPH·、·OH和O2-·的清除能力。結果表明，柚子皮多糖消化產物在模擬口腔唾液20 min時，DPPH·、·OH和 O2-·清除能力分別達到最高為（58.65±2.67）%、（76.12 ±2.31）%和（16.73 ±2.20）%。在模擬胃液消化時，DPPH·清除率在消化2 h時最強為（70.16±2.26）%，·OH 和 O2-·清除能力在 1 h 時最強，分別達到（58.34±2.45）%和（32.12±1.78）%。 在模擬小腸消化時，DPPH·、·OH和O2-·清除率分別在消化8、6、4 h時達到最強。在模擬小腸消化8 h時，DPPH·清除率達到了（47.22±2.27）%、·OH 在消化 6 h時達到最大為（68.50±2.24）%，O2-·清除率在消化時間為 4 h時達到最大為（53.80±2.15）%。