冠突散囊菌在不同培養環境下生長特性的研究

劉韋，張曉葉，張格超，何軍峰，張磊，王海燕

（1.陜西中醫藥大學實驗中心，陜西 咸陽 712046；2.西咸新區金葉茯茶有限公司生產部，陜西 西安 713700；3.西安市人民醫院陜西省眼科醫院，陜西 西安 710004）

冠突散囊菌（Eurotium cristatum，E.C.）是茯磚茶發花過程中的優勢菌種，又名“金花菌”，其產生的閉囊殼數量是判斷茯磚茶品質優劣的重要指標[1]。然而茯磚茶傳統加工工藝繁雜，茯磚茶生產廠家對“金花菌”生長特性缺乏了解，造成產品質量可控性較差，產品形式單一等問題[2-3]，而不同原料和地域對“金花菌”生長的影響也是我們關注的重點。

茯磚茶是工藝最復雜的黑茶產品，其加工工藝可以簡單劃分為：原料篩分—拼配—加茶汁—稱重投茶—汽蒸—壓制—入烘發花—干燥7個工序，每一道工序對于E.C.的生長都有其特有的意義，如果能對這些核心的系列工藝進行研究并嚴格控制，將對產品的質量把控有重要作用。有報道E.C.不但可在紅茶、白茶、綠茶等山茶科植物上生長，而且在枇杷葉、銀杏葉等植物材料也可以良好“發花”[4]。E.C.接種至綠茶后的水提物對高脂斑馬魚模型有很強的降脂活性；接種至銀杏葉，可顯著改善其口感和氣味，并提高總蛋白、聚戊烯乙酸酯含量和抗氧化能力；接種至豆渣，再進行體外α-葡萄糖苷酶活性分析及血糖檢測，發現發酵產物可明顯降低餐后血糖水平；E.C.發酵野葛、粉葛、葛渣可提高總黃酮和葛根素含量；以甜菜粉作為培養基，使用E.C.發酵，可以產生高效降脂的他汀類藥物[5-9]。上述利用E.C.對原料進行深度加工的研究有利于復合保健品的開發，但E.C.在不同植物材料上生長是否具有普遍性及其生長特征值得關注。

E.C.在國外發現的并不多，但在中國因作為茯磚茶中的優勢微生物分布較為普遍，不同分布地域氣候環境不同，茯磚茶中E.C.可能會存在遺傳多樣性。我們前期研究發現[10]，在涇陽發花的綠茶、白茶、黑茶其子囊孢子的赤道冠具有較多小孔，其特征是否可以作為其鑒定標志，本研究將進一步證實。

因此，本研究將通過改變加工工藝、生長基質和生長地域對E.C.的生長特性進行綜合分析，這對于提高E.C.的綜合使用價值，提供理論基礎，并為開發全新茯茶，為行業的再發展提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

滇紅茶（black tea，BT）、綠茶（green tea，GT）、黑毛茶（dark tea，DT）、白茶（white tea，WT）、烏龍茶（oolong）、黃茶（yellow tea，YT）：西咸新區金葉茯茶有限公司。

葉類（花椒葉、淡竹葉、蒲公英、小薊）、果實類（沙棘、小茴香、皺木瓜、棗、枸杞、砂仁、化橘紅、紫蘇子、八角茴香、佛手）、種仁類（芡實、白蓮子、酸棗仁、決明子、枳椇子）、花類（金銀花、杭白菊）、根莖類（干姜、百合、玉竹）和菌核類（茯苓）：陜西涇河新城涇陽益康大藥房。

原料Ma（黑毛茶小葉種一級）、Mb（黑毛茶小葉種二級）：湖南桃源縣巖吾溪茶業有限公司；Mc（黑毛茶小葉種一級）：陜西平利縣八仙云霧有限公司。

成品茯磚茶信息見表1。

表1 供試茶樣編號及來源Table 1 The number and source of tea samples

馬鈴薯瓊脂葡萄糖培養基（potato dextrose agar medium，PDA）、孟加拉紅培養基（rose bengal medium，RBM）、氯硝胺18%甘油瓊脂培養基（dichloran glycerol 18% agar medium，DG-18）、髙鹽察氏培養基（salt czapek-dox agar medium，SCDA）、胰酪大豆胨瓊脂培養基（tryptic soy agar medium，TSA）、馬鈴薯液體培養基：青島海博生物技術有限公司；DNA提取試劑盒、DNA聚合酶（5 U/μL）、限制性內切酶（15 U/μL）、T4 DNA 連接酶（350 U/μL）、DNA 快速純化/回收試劑盒、質粒提取試劑盒、T載體：日本TaKaRa公司。

1.2 儀器

M205體視顯微鏡：德國萊卡公司；PL602E電子天平：瑞士梅特勒公司；H1750R離心機：中國湘儀公司；細菌培養箱：中國海爾公司；PCR儀：美國伯樂公司；水浴鍋：英國格蘭特公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同加工參數的茯磚茶制備

傳統工藝為原料或拼配料-汽蒸-渥堆-加茶汁至含水量-汽蒸壓制-定型-退模-進烘房發花-干燥。

投茶量：不同投茶量組分為 450、500、550 g，含梗量均為5%，入烘水分均為30%。400 g機制模具尺寸為14.6 cm×9.8 cm×3.7 cm，體積為529.4 cm3，換算后不同投茶量的壓制密度（density，ρ）分別為ρ1=0.85、ρ2=0.94、ρ3=1.04。 原料使用 Ma，制備 3 次（n=3）。

茶梗：不同茶梗（tea stalk，S）含量茯磚茶組分別為S1=5%、S2=10%、S3=15%，投茶量均為500 g，入烘水分均為30%。原料使用Ma，制備3次（n=3）。

入烘水分：不同入烘水分（moisture，M）茯磚茶組分別為M1=30%、M2=40%、M3=50%，投茶量均為500 g，梗含量均為5%。原料使用Ma，制備3次（n=3）。其中為驗證入烘水分結果，增加使用原料Mb和Mc（n=3），cd代表閉囊殼直徑，wec代表水浸出物。

水浸出物、菌落計數分別參照國標GB/T 8305—2013《茶 水浸出物測定》，GB 4789.15—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢查霉菌和酵母計數》進行。

1.3.2 不同生長基質的制備

茶類基質采用傳統茯磚茶工藝壓制，BT、GT、DT、WT、Oolong和YT的投茶量均為500 g，含梗量均為5%，入烘水分均為30%。非茶類供試基質制備方法，將購買回來的非茶類供試基質洗凈并晾去表面水。葉類和花類按照茯茶加工工藝，投茶量均為500 g，含梗量均為5%，入烘水分均為30%；果實類、根莖類、種仁類和菌核類均拼配或不拼配20%～30%的黑茶，再按照茯茶加工工藝，投茶量均為500 g，含梗量均為5%，入烘水分均為30%。

1.3.3 E.C.分離與培養

E.C.的培養參照國標GB 4789.15—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢查霉菌和酵母計數》進行，稱取25 g各檢測樣品（不同投茶量、壓制密度、梗含量、BT、GT、DT、WT、Oolong、YT、F1SJ、F2SJ、F3GL、F4HA、F5HY、F6GT、F7SY樣品），加入含有玻璃珠的無菌水，振搖 30min，取振搖液 1mL，梯度稀釋為 10-2、10-3、10-4，吸取各稀釋度1 mL，使用混澆法，放入培養箱中培養7 d。

1.3.4 E.C.鑒定

1.3.4.1 形態學鑒定

使用混澆法將不同產區E.C.菌株分離在PDA、RBM、DG-18、TSA、SCDA 平板上，28℃培養 5 d～7 d 左右，觀察菌落的形態特征，將數量最多的微生物確認為茶樣中的優勢菌種。

各產區茶磚，取樣，直接蒸鍍金屬膜，掃描電鏡觀察，使用《中國真菌志》第五卷進行形態學鑒定和閉囊殼直徑測量（n=100）。

1.3.4.2 分子生物學鑒定

將1.3.4.1純化的E.C.接種到馬鈴薯液體培養基中，30℃條件下在搖床中培養5 d～7 d，離心收集菌體，使用DNA提取試劑盒提取基因組。離心收集樣品菌體，使用DNA提取試劑盒提取基因組。PCR擴增真菌ITS序列（GenBank查找，Primer5.0設計），引物序列JY1（5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3′）和 JY2（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC 3′）。 純化目的片段后，連接T載體，測序由上海生工生物工程有限公司完成。測序結果在NCBI數據庫中，使用Blast和DNAMAN工具進行比對和同源性分析。

1.4 數據處理

相關試驗數據使用SPSS18.0統計軟件分析，以均值±標準差進行統計描述。組間的多重比較使用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 E.C.生長的工藝條件

茶水浸出物與茶產品質量呈正相關，E.C.的數量和大小是茯磚茶品質的重要標志，因此本研究選擇水浸出物、菌落計數和閉囊殼直徑作為評判產品優劣指標。經壓制，烘房“發花”，常規質檢流程，表明不同壓制密度（ρ1=0.85，ρ2=0.94，ρ3=1.04）茯磚茶，不同茶梗含量茯磚茶（S1=5%，S2=10%，S3=15%），不同入烘水分茯磚茶（M1=30%，M2=40%，M3=50%）均可以普遍發花，茶磚內無雜菌。

不同發花條件對茯茶水浸出物、E.C.數量和E.C.閉囊殼直徑的影響見圖1。

圖1 不同發花條件對茯茶水浸出物、E.C.數量和E.C.閉囊殼直徑的影響Fig.1 The effect of different fermentation conditions on the water extract，the number and the diameter of E.C.

隨梗含量增加，“金花”菌數量逐漸增加，茶水浸出物逐漸減少，“金花”菌數量的極大值出現在S3組（89.6±6.2）×104CFU/g，閉囊殼直徑逐漸增加。

隨壓制密度增加，“金花”菌數量逐漸減少，茶水浸出物逐漸增加，“金花”菌數量的極大值出現在ρ1組（66.3±4.6）×104CFU/g，但茶水浸出物的極大值均出現在ρ3組，閉囊殼直徑先減小后增加。

隨入烘的含水量增加，“金花”菌數量先增加后減少，“金花”菌數量的極大值出現在 M2 組（41.6±0.9）×104CFU/g，但組間差異無統計學意義。

不同入烘水分對E.C.閉囊殼直徑的影響見圖2。依據標準質檢，發現隨入烘水分增加，E.C.呈簇狀生長，多數連接為片狀，閉囊殼直徑顯著增加，M1a=（77.17±10.78）μm，M2a=（86.71±11.67）μm，M3a=（100.42±12.22）μm，且隨閉囊殼直徑的增加，茶水浸出物呈上升趨勢，茶磚撬開后，明顯可見“金花”茂盛，片狀連接且飽滿。進一步使用不同等級黑茶進行入烘水分試驗驗證了此結果，即隨著入烘水分增加閉囊殼直徑增加，水浸出物增加（圖3）。

圖2 不同入烘水分對E.C.閉囊殼直徑的影響Fig.2 The effect of different tea brick moisture before fermentation on the diameter of E.C.

圖3 不同等級黑茶不同水分入烘發花對閉囊殼直徑和水浸出物的影響Fig.3 The effect of different grades of dark tea brick moisture before fermentation on the water extract and the diameter of E.C.

2.2 E.C.生長的原料基質

E.C.在白茶（WT）、紅茶（BT）、綠茶（GT）、烏龍茶（Oolong）和黃茶（YT）上的形態特征，以及分離后的E.C.在孟加拉紅培養基（RBM）上第2、7天后形態特征見圖4，E.C.在非茶類受試材料的形態特征見圖5。

圖4 E.C.在茶類受試材料和孟加拉紅培養基（RBM）上的形態特征Fig.4 Morphological characteristics of E.C.on tea test materials and RBM

圖5 E.C.在非茶類受試材料的形態特征Fig.5 Morphological characteristics of E.C.on non-tea test materials

依據GB/T 9833.3—2013《緊壓茶第3部分：茯磚茶》 檢驗標準，E.C.在茶類基質（BT、GT、WT、Oolong、YT）和非茶類基質（葉類、果實類、種仁類、花類、根莖類、菌核類）上均可以生長。受試樣品鏡下可見黃色閉囊殼，包纏在發達的菌絲網中，多數閉囊殼顆粒飽滿、茂盛。

參照GB 4789.15—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數》方法，從含有E.C.的樣品中大多獲得了鮮亮，金黃色的子囊孢子菌落，少數樣品分生孢子和子囊孢子可見。其中紅茶發花后樣品的多個稀釋度僅有灰綠色分生孢子菌落生長，而其它基質多為子囊孢子菌落。相比子囊孢子菌落（ascospore colonies，AC），分生孢子（conidia colonies，CC）菌落直徑較大，菌絲生長發達，菌落反面黃色，可見不規則褶皺，呈“米”字形；隨培養時間延長，兩種菌落均不斷增殖，5 d后AC增殖變緩，且均有褐色液體滲出，培養7 d后，子囊孢子菌落直徑為（1.08±0.15）cm。E.C.在孟加拉紅培養基上菌落的生長直徑變化見圖6。

圖6 E.C.在孟加拉紅培養基上菌落的生長直徑Fig.6 The growth diameter of AC and CC on Bengal red medium

2.3 不同產區E.C.的比較

2.3.1 形態學特征

將不同產區茯磚茶樣品經過混澆法培養，接種至PDA、RBM、DG-18、TSA、SCDA 培養基。 結果表明，各培養基優勢菌落均為近似菌株，48 h后，PDA培養基菌落呈黃色；60 h后，TSA和RBM培養基菌落呈黃色；72 h后，DG-18培養基菌落呈黃色；96 h后，SCDA培養基菌落呈黃色。

將不同產區茯茶E.C.分離后，在PDA、RBM、TSA、DG-18和SCDA培養基上生長的菌落特征見圖7。

圖7 不同產區茯茶E.C.在不同培養基生長的菌落特征Fig.7 Characteristics of E.C.from different areas on different media

不同產區優勢菌在特定培養基的培養過程中，形態學差異不大。在TSA、RBM、PDA培養基上，菌落呈較規則圓形，致密，單個菌落有環形溝槽存在，孢子囊飽滿，數量多，菌絲形態不明顯。在SCDA、DG-18培養基上，菌體生長2 d～3 d，可見白色絲狀體，逐漸呈鮮黃色，菌落溝槽不明顯，形狀不規則，絨狀，較稀疏，但菌絲形態明顯。

F1SJ、F2SJ、F3GL、F4HA、F5HY、F6GT、F7SY 子囊孢子的掃描電鏡圖見圖8。

圖8 F1SJ、F2SJ、F3GL、F4HA、F5HY、F6GT、F7SY子囊孢子的掃描電鏡圖Fig.8 Scanning electron micrographs of F1SJ,F2SJ,F3GL,F4HA,F5HY,F6GT and F7SY ascospores

掃描電鏡的結果顯示，發花茶樣在電鏡下均有大量的閉囊殼，分布在菌絲網中，多數閉囊殼為飽滿球形，集落樣生長在茶葉表面；子囊孢子均為雙凸透鏡形，凸面明顯粗造，有尖疣，赤道溝明顯，赤道冠具兩個明顯的縱向雞冠狀突起，附近均散布較多小孔。

2.3.2 不同產區E.C.的ITS鑒定和同源性比對

PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜可見600 bp目的條帶見圖9。

圖9 PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜可見600 bp目的條帶Fig.9 A 600 bp target brand was amplified by PCR on the agarose gel

受試樣品經擴大培養，基因組抽提，隨委托上海生工測序。測序結果在NCBI數據庫中進行blast比對，比對結果表明該序列與Eurotiumcristatum（Sequence ID：MK346334.1）相似度100%。

不同茯茶產區ITS序列同源性比較結果見表2。

表2 不同茯茶產區ITS序列同源性比較結果Table 2 The comparison of ITS sequence homology of different Fucha tea areas %

同源性分析結果表明，F1SJ、F2SJ、F3GL、F4HA、F5HY、F6GY、F7SY菌落序列同源性在97.5%～99.6%之間，陜西涇陽“發花”的茯磚茶（F1SJ、F2SJ）同源性最低出現在F5HY和F6GT組（98.3%和97.5%），最高值出現在F7SY和F1SJ組（99.4%和99.2%）。

3 討論與結論

茯磚茶的加工過程中，茶梗含量、壓制密度、入烘水分是生產工藝中的重要控制點。結果表明，隨入烘水分含量增加，雖然E.C.菌數量變化不明顯，但水浸出物和E.C.菌閉囊殼直徑顯著增加。而當茶梗含量增加至10%以上，雖然E.C.菌數量和閉囊殼直徑顯著增加，但水浸出物降低，同時國家標準規定梗含量不能超過10%，而且茶梗含量會使茶磚表面花雜，口感粗老。壓制密度增加，水浸出物和閉囊殼直徑顯著增加，但E.C.菌數量顯著減少，同時會增加茶磚的撬散難度，使消費者體感降低。因此，結合茯茶理化指標檢驗標準，就傳統茯磚茶加工工藝過程而言E.C.菌生長具有可控性，而調控入烘茶磚的水分，是促進E.C.生長，抑制青霉、黑曲霉等雜菌繁殖的重要因素，對于產品質量優劣是比較有效的控制方法。

E.C.是茯磚茶發酵過程中的優勢菌種，一直以來茯磚茶以茶科茶屬的茶樹葉為原料制作，以往的冠突散囊菌研究主要集中在它對茶葉的影響[11-13]，近年來，利用微生物發酵以提高植物特別是藥用植物的活性成分的相關研究[14-15]越來越得到關注，E.C.的開發就是其中之一。現代研究結果表明，E.C.與茶葉或非茶類相互作用后，有豐富的生理學，藥理學活性，多數活性檢測結果甚至優于未發酵組。使用茯磚茶水提物對高脂飼料喂養鼠體內總膽固醇，甘油三酯，高密度脂蛋白膽固醇有劑量依賴性的降低作用[16]。利用E.C.菌對燕麥進行固態發酵，能夠顯著提升燕麥中的黃酮含量；發酵后的苦丁苦味消失，揮發性物質發生了復雜而顯著的變化[17]；發酵后的杜仲葉，綠原酸減少了25.7%[18-19]。那么使用傳統茯茶加工工藝，本研究進一步使用傳統茯茶加工藝，觀察E.C.在包括茶葉等不同生長基質上發花的普遍性及生長特性。我們在對六大茶類及25種非茶類進行發花試驗，結果表明在一定生產條件下，E.C.菌生長有普遍性，并可與傳統茯磚茶生產結合。與傳統茯茶發花相似，在14 d～21 d，E.C.菌在多數葉類、果實類、種仁類、花類、根莖和菌核類受試樣品生長普遍茂盛，金花顆粒飽滿，多數閉囊殼分布在網狀菌絲中，為飽滿球形，集落樣生長在基質表面。

茯磚茶可謂所有黑茶類茶葉中加工工藝最復雜、最獨特的產品，因其特有功效和發展歷程被譽為“絲綢之路的神秘之茶”，其茶的主產地是湖南、湖北、四川、陜西等[20]。不同產區因氣候和生產環境不同，所生產的茶葉中E.C.可能具有地域性特征。在真菌的分類地位研究中，形態結構是經典分類法的基礎，但僅采用傳統的形態學方法很難對此菌株進行準確地分類鑒定。ITS序列是核糖體DNA中的中度保守區域，易于測序，其序列保守性非常適合真菌的分類鑒定研究[2]。前期研究發現[10]在涇陽發花的綠茶、白茶、黑茶其子囊孢子赤道冠具有較多小孔，與王文濤等發現一致[21]。本研究在此基礎上選取6個地區生產的茯磚茶進一步驗證，發現各產區E.C.菌為優勢近似菌株，均具有孔狀結構，并不能作為涇陽茯磚茶的特異性標志，這7株菌株分子生物學鑒定相似性大于97.5%，同源性較高，在形態學上與分子水平基本一致，說明E.C.菌有遺傳上的穩定性。

綜上，“金花”菌生長特性具有一定的普遍性，可控性和非地域性。如將茯茶的加工工藝與非茶類類結合，充分發揮“發花”，借助E.C.菌發酵過程中豐富的酶類與其相互作用，能否在保健和預防疾病方面做出貢獻，將對E.C.菌產品開發提供新的思路和理論基礎。