屎腸球菌R2培養條件優化及酸漿發酵劑的制備

陳志娜，沈業橋，葉韜，黃琳

（1.淮南師范學院生物工程學院，安徽 淮南 232038；2.資源與環境生物技術安徽普通高校重點實驗室，安徽 淮南 232038）

屎腸球菌（Enterococcus faecium）屬于乳酸菌的一種，因為在代謝過程中產生乙酸和乳酸，能夠降低腸道內的pH值，可以維持和調節動物腸道菌群生態平衡[1]，特別是在幼齡動物腸道保健和疾病的防疫以及治療上有突出表現。屎腸球菌廣泛存在于傳統乳制品[2-4]、泡菜[5]、豆醬[6]、香腸[7]等發酵食品中，可以影響食品的香氣、風味、質地，還能產生多種有益成分[8]。課題組前期從泡菜中篩選出一株可用于酸漿發酵的屎腸球菌E.faecium R2[9]，對其進行了安全性評價[10]，證明了其實用性與安全性，可用于酸漿發酵劑的制備，具有廣闊的應用前景。活菌數量是衡量發酵劑性能的主要指標，研究表明相對于厭氧發酵，乳酸菌利用有氧增殖可顯著提高菌體數量，減少發酵劑生產成本。另外，進行有氧代謝的乳酸菌的長期存活能力是發酵代謝的106倍～108倍，可延長發酵劑的貨架期[11]。因此，通過有氧代謝方式來提高乳酸菌細胞數量，為規模化發酵劑制備工藝提供新的思路[12]。

研究表明添加外源血紅素可使腸球菌進行有氧呼吸代謝[13-14]。因此，本文以E.faecium R2為研究對象，驗證該菌株是否可進行有氧呼吸代謝，進而采用單因素和正交試驗設計對其有氧呼吸增殖條件進行優化，獲得純種酸漿發酵劑，并對該發酵劑的發酵性能進行評價，以期為酸漿發酵劑的推廣和大豆黃漿水的開發利用提供理論依據和試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

屎腸球菌（E.faecium R2）CGMCC 14944：中國普通微生物菌種保藏管理中心；脫脂乳粉：內蒙古伊利實業集團股份有限公司；1-谷氨酸鈉鹽、氯化血紅素：上海麥克林生化科技有限公司；蛋白胨、葡萄糖、牛肉膏、蔗糖：國藥集團化學試劑有限公司。

0.5 mg/mL血紅素溶液：稱取0.05 g血紅素，將其溶于0.05 mol/L的NaOH水溶液中，4℃下于棕色廣口瓶中保存備用。

乳酸細菌培養基（MRS）：蛋白胨 10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、葡萄糖 20.0 g、磷酸氫二鉀 2.0 g、乙酸鈉5.0 g、硫酸錳0.25 g、硫酸鎂0.58 g、檸檬酸二銨2.0 g、吐溫-80 1.0 mL、蒸餾水 1 L，pH 6.2，121 ℃下滅菌20 min。MRS固體培養基再添加瓊脂粉18.0 g，用于培養計數。

取30 mL黃漿水加入到250 mL錐形瓶中，為黃漿水培養基，在此基礎上添加60 μL 0.5 mg/mL的血紅素溶液，即得黃漿水血紅素培養基，121℃下滅菌20 min，備用。

1.2 設備和儀器

JA2203N電子天平：上海民橋精密科學儀器有限公司；UV2300紫外可見分光光度計：上海天美科學儀器有限公司；ZHWY-100B恒溫振蕩培養箱：上海智誠分析儀器制造廠；LDZF-30KB立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械；SW-CJ-2D雙人單面垂直凈化工作臺：蘇州博萊爾凈化設備有限公司；pHS-3CpH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；LRH-250-A生化培養箱：廣東泰宏君科學儀器股份有限公司；HZP-250全溫培養振蕩器：上海精宏實驗設備有限公司；TS-200B臺式空氣浴恒溫搖床：上海捷呈實驗儀器有限公司；JYC-21ES55C電磁爐：九陽股份有限公司；槳式攪拌器：鹽城市沃特機械設備有限公司；RMQYL立式油壓千斤頂：榮美液壓機械制造有限公司；FD-1A-50臺式真空冷凍干燥機：北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將屎腸球菌R2接種到MRS培養基中，于37℃下靜置培養14 h，備用。

1.3.2 黃漿水的制備

取700 g黃豆用蒸餾水于25℃下浸泡8 h后，豆水比1∶8（g/mL）打漿，用100目尼龍篩布過濾除渣，所得生豆漿煮沸并維持5 min，當降溫至85℃時，輕輕攪動下緩緩加入酸漿，直至出現均勻腦花，添加量為16%（質量分數）左右。85℃下蹲腦20 min后，將豆花倒入豆腐模具中于5.5 kPa～6.0 kPa壓力下壓漿30 min，得到黃漿水[9]。試驗用酸漿參考葉青等[15]的方法采用三級豆腐黃腐黃漿水為發酵基質制備而成，以消除原鹵鹽凝固劑的影響。

1.3.3 屎腸球菌R2在傳統發酵與有氧呼吸條件下的生長趨勢

將活化后的屎腸球菌R2按3%的接種量分別接種到黃漿水培養基與黃漿水血紅素培養基中，分別在傳統發酵（無氧無血紅素：靜置培養，黃漿水培養基，用NoOx/NoH表示）、有氧呼吸（有氧有血紅素：150r/min搖床培養，黃漿水血紅素培養基，用Ox/H表示）2種條件下于37℃下培養24 h，于6、12、24 h測定菌種OD600值。

1.3.4 屎腸球菌R2有氧呼吸增殖條件單因素優化

將活化后的屎腸球菌R2按3%接種量接入黃漿水血紅素培養基，通過測定OD600值來比較不同溫度（32、37、42 ℃）、轉速（125、150、175 r/min）、血紅素濃度（1.0、2.0、3.0 μg/mL）、初始 pH（5.6、5.9、6.2）對其增殖效果的影響。

1.3.5 屎腸球菌R2有氧呼吸增殖條件正交試驗優化

根據單因素試驗結果，選擇溫度、轉速、血紅素濃度、初始pH值4個因素進行優化，以發酵液培養24 h的OD600值為檢測指標，進行L9（34）正交試驗設計，確定最佳增殖條件，因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3.6 發酵劑菌粉的制備

分別以傳統發酵（No Ox/No H）和最適有氧呼吸（Ox/H）條件對屎腸球菌R2進行培養，24 h后取菌液置于離心管中，以轉速5 000 r/min離心10 min后，棄去上清液，加適量生理鹽水溶解菌泥，添加冷凍保護劑（谷氨酸鈉5%、脫脂乳10%、蔗糖10%）[16]，于-80℃下過夜冷凍；取凍結菌泥放于真空冷凍干燥機中進行干燥，24 h后完全干燥成菌粉狀態，獲得純種酸漿發酵劑。

1.3.7 酸漿發酵劑品質評價

活菌數的測定：參考GB4789.35—2016《食品安全國家標準食品微生物檢驗乳酸菌檢驗》[17]，測定兩種方式制備的發酵劑中的活菌數。

發酵性能的測定：準確稱取兩種發酵劑菌粉各0.1g分別接種到黃漿水培養基中，37℃靜置培養36 h，每隔8 h測量其pH值。

1.4 數據處理與統計分析

數據表示為平均值±標準偏差，使用SPSS16.0軟件對數據進行統計處理和方差顯著性分析，圖形數據采用Origin2018軟件制作。

2 結果與分析

2.1 屎腸球菌R2在傳統發酵與有氧呼吸條件下的生長曲線

屎腸球菌R2在傳統發酵與有氧呼吸條件下的生長趨勢如圖1所示。

圖1 屎腸球菌R2在傳統發酵與有氧呼吸條件下的生長趨勢Fig.1 Growth trends of E.faecium R2 under traditional fermentation and aerobic respiration conditions

結果表明，培養前6 h時，No Ox/No H與Ox/H兩種培養條件下菌種生長量無顯著差異；培養12 h后，兩者出現顯著差異，Ox/H培養條件下的生物量顯著高于No Ox/No H條件下的生物量，說明Ox/H培養條件對屎腸球菌R2的生長沒有產生迫害作用，反而有促進作用。PATRICK等[18]研究表明，當血紅素和氧氣存在時，乳球菌最初的生長是通過發酵代謝方式實現的，在培養8 h之后才將代謝方式轉換為有氧呼吸代謝，生物量繼續增加，可能細胞對血紅素的攝取等因素限制了對數前期細胞血紅色素的活性。

想要做好高校的內部控制工作，從而做好高校的財務風險管控，就必須要對內部控制做好有效的監督。對高校內部控制進行監督可以保證高校內部控制工作的合理性以及科學性，然而在我國的高校中，內部控制的監督工作基本上都是由財務內部人員來進行的，沒有做到讓專業的人員來進行，從而會使得監督流于形式，而且這種監督方式是非常不科學的，監督的結果也是難以令人滿意的。還有很多高校在內部控制工作當中沒有內部控制的監督機制，造成對內部控制工作的管理極為不嚴謹，由于缺少有效的監督，內部控制工作一旦出現問題可能不能及時發現和上報，最終造成高校的財務風險，從而影響到高校的財務風險管控工作正常運作。

2.2 屎腸球菌R2有氧呼吸培養條件單因素優化

2.2.1 溫度對屎腸球菌R2增殖的影響

在培養過程中，菌株生長代謝的培養溫度，一方面直接影響到菌株細胞內的各種酶活性[19]，控制菌株對營養物質的吸收與利用，從而影響菌種生物量。另一方面菌種生長會產生各種熱量，若發酵環境溫度過高，產生熱量不能及時消散，則會對菌種產生影響，抑制其的生長。因此控制環境溫度可以改變菌種培養周期的時長。溫度對屎腸球菌R2生長的影響見圖2。

圖2 溫度對屎腸球菌R2生長的影響Fig.2 Effects of temperature on growth of E.faecium R2

從圖2可以看出，溫度過高或過低均會影響屎腸球菌的生長，當培養溫度為37℃時，培養24 h后菌液的OD600值最高，生物量最大。

2.2.2 初始pH值對屎腸球菌R2增殖的影響

初始pH值可能影響乳酸菌膜轉運蛋白和胞內酶的活性，當發酵液初始pH值下降到5.3左右時，菌株可從發酵代謝轉變為更有利于菌株生長的有氧呼吸，生物量進一步增加[18]。初始pH值對屎腸球菌R2生長的影響見圖3。

如圖3所示，培養環境的初始pH值為5.9時，菌株有氧呼吸培養24 h后OD600值最高，生物量最大。施為家[19]研究表明，發酵液pH值會影響菌株胞內積累血紅素的能力，進而影響有氧呼吸的效率。

圖3 初始pH值對屎腸球菌R2生長的影響Fig.3 Effect of initial pH on growth of E.faecium R2

2.2.3 血紅素對屎腸球菌R2增殖的影響

圖4 血紅素濃度對屎腸球菌R2生長的影響Fig.4 Effect of heme concentration on growth of E.faecium R2

如圖4所示，在血紅素終濃度為2.0 μg/mL的有氧呼吸條件下培養24 h能獲得最大生物量，而高濃度的血紅素對菌株的生長存在一定的抑制。

2.2.4 轉速對屎腸球菌R2增殖的影響

改變搖床的轉速可以改變菌株培養環境的含氧量。轉速對屎腸球菌R2生長的影響見圖5。

圖5 轉速對屎腸球菌R2生長的影響Fig.5 Effect of rotate speed on growth of E.faecium R2

如圖5所示，恒溫搖床轉速為150 r/min時，OD600值最高，高于轉速125 r/min和175 r/min條件下的OD600值。研究表明，腸球菌在進行有氧呼吸代謝時，如果通氣過多，未被利用的氧氣會對菌體細胞造成損傷[13]。

2.3 屎腸球菌R2有氧呼吸增殖條件正交試驗優化

屎腸球菌R2有氧呼吸增殖條件正交試驗優化結果及極差分析結果如表2所示。

表2 正交試驗結果Table 2 The results of orthogonal experiment

從表2可以看出，以OD600為檢測指標，按照極差大小各因素對屎腸球菌R2增殖效果影響的主次順序為：A＞D＞C＞B。按 A1B3C3D2條件進行驗證試驗，結果顯示屎腸球菌R2培養24 h的OD600值為2.675，高于A2B3C1D2（正交試驗中OD600值最高）。因此，屎腸球菌R2的最適增殖條件為溫度32℃、轉速175 r/min、血紅素添加量 3.0 μg/mL、初始 pH5.9。

2.4 發酵劑品質評價

2.4.1 活菌數的測定

采用平板計數法分別測定Ox/H和No Ox/No H兩種方式獲得的發酵劑菌粉中的活菌數，結果見圖6。

圖6 兩種培養條件下制備的菌粉的活菌數Fig.6 Viable counts of bacterial powers cultivated under condition different condition

結果表明采用No Ox/No H和Ox/H兩種方式獲得的發酵劑菌粉中的活菌數分別為1.22×108CFU/g和1.33×109CFU/g，后者明顯高于前者，說明進行有氧呼吸代謝的屎腸球菌R2具有更強的生存能力，與PATRICK等[18]的研究結論一致。

2.4.2 產酸性能的測定

研究表明，在通氣和添加外源血紅素的條件下，通過有氧呼吸代謝下生產出來的乳酸菌發酵劑對標準乳制品生產條件下生產的干酪或發酵乳的品質的影響不大[19]。兩種培養方式制備的發酵劑菌粉的產酸性能如圖7所示。

圖7 兩種培養條件下制備的菌粉的產酸性能Fig.7 Acid-producing ability of bacterial powers cultivated under condition different condition

結果表明，采用No Ox/No H方式獲得發酵劑菌粉對黃漿水的發酵過程與采用No Ox/No H方式獲得發酵劑菌粉基本一致，在發酵36 h后pH值均下降到3.6左右。說明采用No Ox/No H方式獲得的發酵劑菌粉仍具有較好的發酵特性。

3 結論

本文以OD600為檢測指標，采用單因素和正交試驗優化了屎腸球菌R2有氧呼吸增殖條件，并對屎腸球菌R2酸漿發酵劑品質進行評價。屎腸球菌R2有氧呼吸最適增殖條件為溫度32℃、轉速175 r/min、血紅素添加量3.0 μg/mL、初始pH 5.9。在這種條件下培養的屎腸球菌R2經冷凍干燥制得酸漿發酵劑，該發酵劑的活菌數達到1.33×109CFU/g，產酸性能良好，可用于酸漿生產。