美拉德反應及其產物在食品改性中的應用研究進展

張翼鵬，段焰青，張曉燕，殷春雁，寧國寶，雷聲，李燦鵬，劉自單*，吳子健*

（1.云南中煙工業有限責任公司技術中心，云南 昆明 650231；2.天津商業大學生物技術與食品科學院，天津 300143；3.紅河衛生職業學院，云南 紅河 661199；4.云南大學化學科學與工程學院，云南 昆明 650091）

1912年，法國化學家L.C.Maillard首先報道了葡萄糖和甘氨酸可在加熱條件下反應生成褐色物質，其主要成分是棕色的類黑素。1953年，Hodge等[1]把這個反應正式命名為美拉德反應（Maillard reaction）。美拉德反應本質上是指還原糖、醛、酮等的羰基與蛋白質、氨基酸、肽等含氮物的游離氨基之間發生的一系列脫水縮合反應[2-3]。食品加工中，美拉德反應及其產物不僅能夠改善食品的功能特性，如食品風味、溶解性、熱穩定性、黏度、乳化性、起泡性、凝膠性等，還能影響食品的抗氧化活性、抗菌活性、抗褐變活性、降血壓、消化性、生物學活性。本文主要闡述了美拉德反應產物（Maillard reaction products，MRPs）的制備方法及其在食品改性中的應用，特別是對食品蛋白的功能特性改善的影響，并對今后的美拉德反應的研發作了展望。

1 MRPs制備及分析方法

MRPs的制備流程包括樣品制備、MRPs的提取、分離、濃縮富集、反應產物的鑒定等[4-5]。制備樣品必須對樣品原料性質和特點進行了解，選擇具有典型和代表性的部位，采用適當的方法。MRPs的分離分析手段包括液/液萃取、液/固萃取、固相萃取、超亞臨界流體萃取、微波、超聲波輔助萃取、蒸餾提取法、動態頂空提取、溶劑輔助蒸發提取等。MRPs的濃縮富集技術主要有蒸發濃縮和吸附濃縮，常用儀器有K-D濃縮器和旋轉蒸發儀。

MRPs性質和結構的分析鑒定技術包括紅外光譜、熒光光譜、液相-串聯質譜、氣相色譜-質譜聯用和核磁共振等。目前氣相色譜-嗅聞-質譜聯用既可以鑒定化合物，還能鑒定風味物質的特點[6-7]。另外，同位素示蹤法也是MRPs分析手段中有效的常用輔助分析技術，有助于探索產物的形成途徑和形成機理[8-10]，為MRPs的精準合成（定向合成）提供了較好的表征手段。

2 美拉德反應及其產物對食品功能特性的改善

2.1 食品風味

美拉德反應在食品的顏色、香氣、口味等風味特征的形成過程中起到重要作用[11]。通過控制原料、溫度等反應參數，能夠得到一系列不同風味的物質[12]，例如，核糖可與半胍氨酸及谷氨酸分別反應，產生豬肉燒烤味和牛肉燒烤味[13]；在100℃～150℃和180℃，葡萄糖和纈氨酸反應產生燒烤味和巧克力味[14]；木糖和酵母水解蛋白在90℃和169℃溫度下反應，分別產生餅干味和醬油味[15]。同種食品不同的加工方法產生的香氣也不同，例如，煮熟的馬鈴薯產生125種香氣，而烤熟的馬鈴薯能產生250種香氣[16]。美拉德反應還能用于咸味物質等一些調味料的生產[17]，目前，一些咸味物質已經廣泛應用于冰凍食物、罐頭、方便面、香腸和咸味零食等食品加工中[18]。這些研究說明美拉德反應是改善食品風味較為有效的方法。但是，部分美拉德反應形成的烷基嘧啶和吡咯等化合物也會產生一些令人不悅的味道[19]，因此如何控制好食品加工中美拉德反應的條件進而產生人們期望獲得的風味物質是今后研究熱點之一。此外，隨著人們生活水平的提高，對食品風味也提出了更高的要求，這也促使食品化學工作者研發更多、更新的食品風味物質來滿足不同的消費人群。

2.2 溶解性

蛋白質的溶解度會直接影響食品的黏度、凝膠性、起泡性、乳化性等功能特性，而美拉德反應可通過提高食品蛋白的溶解性，進而改善其功能特性。美拉德反應改善蛋白溶解性的原因在于引入糖的親水基團（主要是羥基基團）有利于提高蛋白溶解性，同時降低糖基化蛋白質的等電點。Jiménez-Casta?o等[20]研究表明，pH 5.0時，α-乳白蛋白（α-la）、β-乳球蛋白（βlg）以及牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）受葡聚糖的糖基化修飾，其溶解度提高。Martinez-Alvarenga等[21]研究也表明，乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）經麥芽糊精糖基化修飾，溶解度增強，可能是由于糖基化作用在蛋白質表面引入了羥基基團，致使蛋白質的等電點由5降低至4～4.5，乳清分離蛋白（WPI）和乳清水解蛋白（hydrolysed whey protein isolate，HWPI）經乳糖和果糖的糖基化作用，其溶解度均得到提高[22]。然而，也有報道表明，美拉德反應后的糖基化蛋白的溶解性降低。蛋清蛋白與果膠[23]、豬肉蛋白與葡聚糖[24]結合后，溶解度降低，其原因在于相對于天然蛋白，經糖基化作用的蛋白質之間會產生交聯，從而產生更多沉淀；而且美拉德反應的糖大部分為結構復雜的多糖，也可能是導致蛋白溶解性降低的另一個原因。因此，可利用調控糖基化發生的程度來控制多糖-蛋白質美拉德反應產物的溶解性[24]。另外一方面，在美拉德反應之后，蛋白質溶解性降低的原因可能是加熱時間過長，蛋白質內部的疏水基團外露，導致表面疏水性增加從而使蛋白質發生聚集。在有些反應中，也可能是美拉德反應高級階段的MRPs（如3-脫氧葡糖酮醛、乙二醛和甲基乙二醛等）與氨基酸殘基（如賴氨酸）相互作用，形成分子內或分子間的交聯[25]，從而形成蛋白的大分子聚合物。Wang等[26]利用木糖或果糖對大豆分離蛋白進行糖基化修飾，在80℃濕熱條件下反應6 h后蛋白質的溶解度顯著增強，反應時間至10 h后其溶解度呈下降趨勢，其原因可能是美拉德反應進行到最終階段產生了一些難溶的疏水化合物。Cheng等[27]也觀察到類似的現象。

2.3 熱穩定性

高溫通常使蛋白質結構發生改變，產生沉淀從而會影響其功能特性[28]。美拉德反應已成功用于改善溶菌酶、乳清蛋白、豬肉分離蛋白、油菜籽分離蛋白、乳清分離蛋白等食品蛋白的熱穩定性[20，24，29-32]。 這些食源性蛋白經美拉德反應后，使蛋白質分子中引入空間位阻和靜電排斥力，從而阻礙尚未折疊的蛋白質分子發生聚集[33]。美拉德反應中，蛋白質-多糖復合物能增強其乳化液的穩定性，因此可作為高效、穩定的乳化劑應用于冰凍食品中[34]。另外，糖基化修飾的乳清蛋白熱穩定的提高與糖基化的程度、碳水化合物的碳鏈長度以及蛋白質的結合位點密切相關。多糖較單糖具有更強的空間位阻，多糖分子量越大越容易穩定蛋白質[35]。美拉德反應中，蛋白質熱穩定的提高還有助于糖基化修飾，使蛋白質分子親水作用增強，使美拉德反應產物的保水能力增強[26]。在大豆分離蛋白與葡萄糖[36-37]、花生分離蛋白與葡甘聚糖[38]以及花生分離蛋白與葡聚糖/阿拉伯膠[39]之間發生的美拉德反應過程中，均檢測到蛋白質表面親水性增強。蛋白質疏水基團之間的過強的疏水作用力易使蛋白質發生聚集，從而降低其熱穩定性。因此，在美拉德反應中，通過調控反應條件，能獲得高穩定性的蛋白質-多糖復合物，使其作為熱處理食品的功能性成分應用于食品工業中。

2.4 黏度

食品蛋白的黏度也是其重要的功能特性之一。糖基化修飾作用對蛋白質溶液的黏度影響顯著。Oliver等[40]的研究結果表明，酪蛋白與核糖、果糖、葡萄糖、乳糖之間的美拉德反應中，酪蛋白的黏度均有不同程度增加，美拉德反應蛋白產物的黏度從大到小依次為：核糖>葡萄糖>果糖>乳糖。另外，該作者分別利用果糖和果糖-菊粉混合物分別對酪蛋白進行磷酸化修飾，酪蛋白的黏度同樣得到提高[41]。Hiller等[42]研究表明，牛奶蛋白經葡萄糖、乳糖、右旋糖酐和果膠糖基化修飾，蛋白質溶液的黏度分別提高了164%、1 066%、915%和3 462%，這主要是因為蛋白質經糖基化修飾后，分子量、空間位阻和保水性均得到增強。但是，美拉德反應的高級階段也會產生難溶性化合物導致蛋白質黏度下降[23]。美拉德反應產生的蛋白質-碳水化合物能夠增加體系的黏度，防止乳化類產品中乳化劑和泡沫塌陷，應用于食品工業中，能夠確保食品在加工、運輸、儲存階段保持流變特性。美拉德反應會影響食品蛋白的黏度，但是不同種類的食品蛋白在經過美拉德反應之后，其黏度的變化也會有較大差異，實際加工過程中要根據實際需求來確定美拉德反應條件。

2.5 乳化性

蛋白質的糖基化是提高蛋白質乳化特性的重要手段，糖基化不僅可增強蛋白質在水相中的溶解性，而且通過改變蛋白質空間構象，進而增強其柔性提高糖基化蛋白的流動性，使得糖基化蛋白能更快遷移至油/水界面[35]，并且接枝在蛋白質上的多糖又能在油滴之間產生一定的空間排斥，促進蛋白質附著于油滴表面[43-44]。例如：酪蛋白酸鹽-麥芽糊精復合物具有一定的熱穩定性和凍融穩定性，使水包油型乳化液更加穩定，正是由于麥芽糊精糖基部分突出并進入水相，提高了空間穩定性，防止液滴的聚合，形成強有力的生物聚合膜界面[45]。在冰凍食品中，穩定的蛋白質-多糖乳化液是由于糖基化過程中，在油滴之間引入很強的空間排斥力，形成致密的多分子層結構。然而，加熱時間過長會導致太多的疏水基團暴露，蛋白質分子間相互作用增強，最終形成聚集或沉淀；另外，美拉德反應產物的降解也能導致蛋白質乳化性能降低[34]。

乳清分離蛋白和乳清水解蛋白經乳糖和果糖的糖基化修飾，其乳化性增強，是因為糖基化作用形成了可調控的親水-疏水動態平衡[22]。最近，Wang等[26]報道與鴨蛋清蛋白-柑橘果膠復合物相比，鴨蛋清蛋白-麥芽糊精復合物有更穩定的乳化性能，能夠耐受離子強度和酸性環境。另外，大豆分離蛋白與葡萄糖經過干燥加熱條件下的美拉德反應，蛋白的乳化能力增強[46]，然而，大豆分離蛋白和木糖或果糖在濕熱條件下進行美拉德反應，蛋白質的乳化活性降低[26]，這暗示出不同的加熱模式，不同的還原糖和反應條件導致某種蛋白質的功能特性不同。也有報道顯示，蛋白質的疏水作用及柔性是決定其功能特性（如乳化性、起泡性）的重要因素[47-50]。例如，美拉德反應降低了大豆分離蛋白的剛性，增強其柔性，使其快速擴散并吸附到油/水界面。因此，疏水性和柔性可能是蛋白質表面功能特性的靜態和動態因素[36-37]。與未糖基化的蛋白比較，在酸性、高離子強度和高溫等條件下，蛋白質-多糖復合物乳化液有更高的穩定性。因此，糖基化蛋白質可以用作一種優良的乳化劑。

2.6 起泡性

糖基化修飾可以提高蛋白的起泡性和起泡穩定性。蛋白質-多糖復合物的多糖部分具有很好的親水性和界面黏彈度，增強了復合物的保水性，從而提高了泡沫穩定性[42]。并且，糖基化作用能通過調節蛋白質的親脂-親水之間的動態平衡，增強蛋白質-多糖復合物捕獲氣泡的能力，延長氣泡穩定的時間。糖基化通過增強蛋白質的黏彈度，形成加厚致密層，從而包裹在被捕獲的氣泡周圍，防止氣泡破裂[22]。干熱條件下，β-乳球蛋白經葡萄糖和乳糖糖基化修飾后，其泡沫穩定性增強[51]。同樣，乳清分離蛋白經麥芽糊精糖基化修飾后，其起泡能力和泡沫穩定性均增強[21]。另外，乳清分離蛋白和乳清水解蛋白經乳糖和乳果糖糖基化修飾，其起泡性和泡沫穩定性也得到提高[22]。據報道，牛血清蛋白經葡萄糖和甘露糖的糖基化修飾，其親水性增強[52]。酪蛋白經葡萄糖胺糖基化修飾，其親水性也增強[53]，親水性的增強均使其復合物的泡沫穩定增強?？傊?，可以通過美拉德反應調整食品蛋白的表面親水或疏水性來獲得性能較好的起泡劑。

2.7 凝膠性

通過熱誘導食品蛋白，引起變性和聚集，從而形成凝膠。凝膠形成與蛋白質濃度、溫度、pH值、離子強度和加熱時間等因素相關。蛋白質在未折疊狀態下，凝膠形成受多糖共價修飾的影響[54]。Cabodevila等[55]將大豆分離蛋白和木糖或葡萄糖酸-δ-內酯溶液高壓滅菌制得熱誘導凝膠，美拉德反應形成更多的共價交聯，從而提高了膠體的保水性，并增強其凝膠斷裂力和彈性。Armstrong等[56]也有相似報道。以上研究表明蛋白質經多糖糖基化修飾之后，其凝膠穩定性顯著增強，這為創制生物活性物質運載凝膠奠定了良好的基礎。具體美拉德反應對食品功能特性的改善見表1。

表1 美拉德反應對食品功能特性的改善Table 1 Effects of Maillard reaction on the improvement of functional properties of foods

3 美拉德反應對食品生物活性的影響

3.1 抗氧化活性

MRPs（如還原酮、類黑素等）具備抗氧化作用，且抗氧化能力受到諸如反應物濃度、加熱方式、初始pH值、溫度、反應時間等因素的影響[57]。通過金屬螯合能力，活性氧消除能力，過氧化氫清除能力等測定，MRPs顯示了良好的抗氧化活性[58]。MRPs的生物學活性歸因于羥基和吡咯基團的電子轉移能力及還原酮的遞氫作用，以此來終止自由基鏈式反應[59]。研究表明溶菌酶-瓜爾膠復合物的還原性增強取決于復合物自身的電子轉移能力，且熱誘導導致蛋白質變性，暴露出更多的氨基酸殘基，從而能夠給出更多的電子[60]。海藻酸鈉是從褐藻類的海帶或馬尾藻中提取碘和甘露醇之后的副產物，是一種天然多糖，可以和食品蛋白發生糖基化反應，從而增加抗氧化性。已經證明類黑素具有陰離子性質，能夠通過氮原子來螯合金屬離子[61]，類黑素中的吡咯酮和吡喃酮可能提供羥基和酮體等螯合供體[62]。目前，MRPs也作為一種潛在的抗氧化劑，用于抑制果汁[63]、肉類[64]、意大利面[65]、面包[66]、馬鈴薯[67]和奶產品[68]等食品中的氧化反應。美拉德反應對這些產品的風味、顏色和氧化穩定性起到重要作用。

美拉德反應中的蛋白質-糖復合物，由于具備較高的熱穩定性，在高溫條件下不易發生降解而喪失生物活性，因而可以用作熱加工產品中的抗氧化劑和乳化劑。

3.2 抗菌活性

水溶性氨基酸/糖體系或者甜鹵水、啤酒、咖啡等的美拉德反應產生的類黑素具有抗菌活性。和革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌）相比，類黑素對革蘭氏陽性菌（如金黃色葡萄球菌）具有更強的抑制效果[69-70]。樣品經較強的熱處理（如焙烤），能產生更強的抗菌效果[71]。另外，美拉德反應的副產物的抗菌效果也得到了證明，它能與細菌的細胞壁、蛋白質、脂質、核酸等發生反應，從而干擾細菌繁殖[72-73]。將蛋白質-糖復合物添加到食品中，能夠增強食品的微生物安全性，延長保質期。例如，糖基化的殼聚糖，作為一種潛在的抗菌化合物，已成功用于肉類[74-75]、鮮蝦[76]和面條[65]等食品中。由于抗生素的廣泛使用，加上微生物對抗生素的耐藥性，使其抗菌活性下降，MRPs對細菌性病原體有較好的抑制作用，可作為抗生素潛在替代物應用于醫藥行業。

3.3 抗褐變活性

水果和蔬菜中的多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）會使醌氧化為深色顏料，影響產品的營養、功能和感官特性。亞硫酸鹽廣泛用作PPO的抑制劑，但其對咽喉有較大的刺激作用，特別是對哮喘病有不利影響，因此研究人員試圖尋找新的PPO抑制劑[77]。研究表明MRPs能夠顯著降低或抑制食品中酪氨酸酶、過氧化物酶和PPO的活性。例如，半胱氨酸-木糖、半胱氨酸-葡萄糖美拉德反應生成的MRPs能夠最大限度抑制PPO的活性，已廣泛用于抑制蘋果泥、切片蘑菇、蘋果和茄子中的PPO活性[78]。在葡萄糖-精氨酸/組氨酸生成的MRPs存在時，蘋果泥和土豆塊中的酶促褐變反應受到明顯抑制[77]。同樣，在香蒲中添加殼聚糖-麥芽糖美拉德反應產生的MRPs，顯著抑制了PPO活性，香蒲的顏色保持不變。

基于以上研究，MRPs可作為潛在的防褐變劑，在新鮮蔬菜和水果中用于防止酶促褐變反應。MRPs的防褐變作用可能是由于這些化合物之間易形成金屬鍵，從而螯合氧化還原酶（如多酚氧化酶、酪氨酸酶和過氧化物酶）中的金屬離子，使這些酶的活性位點失活從而達到抑制酶促褐變的目的。

3.4 降血壓活性

研究顯示，MRPs中的類黑素能夠有效抑制血管緊張素-I轉移酶（angiotensin I-converting enzyme，ACE）活性，從而降低血壓[79]。一項體外研究表明，從咖啡中提純的類黑素，隨著加熱時間延長，對ACE的抑制作用顯著增強，效果與降血壓肽類似，表明健康與類黑素緊密相關[80]；在另一項體外研究中，葡萄糖-氨基酸溶液（pH值為中性）在100℃下加熱24 h后，提純類黑素部分，試驗表明類黑素具有結構依賴的ACE抑制活性。這些發現暗示類黑素可能用作一種潛在的抗氧化和降血壓成分，用于創制新型功能食品。雖然類似的研究還不多，但將是今后研究的熱點之一。

3.5 可消化性

美拉德反應產物容易被機體消化和利用。研究表明，乳清水解蛋白-乳果糖復合物在模擬的胃部環境中能被完全降解[22]。一般情況下，糖基化修飾不會使蛋白質的二級結構發生太大變化，但往往改變蛋白的三級結構，使蛋白形成“熔融”的部分變性結構，這樣也有利于蛋白酶對蛋白質的消化作用[22]。另外，腸道菌群試驗表明，結腸微生物能夠消耗美拉德產物中的復合物作為自身的碳源和氮源，例如酪蛋白肽-乳果糖/低聚半乳糖[81]，酪蛋白酸鹽/β-乳球蛋白[82]，酪蛋白酸鹽/β-乳球蛋白-半乳糖/乳糖[83]，乳鐵蛋白水解物/低聚半乳糖[84]的發酵物。

美拉德反應產物的生物學活性在食品中的應用如表2所示。

表2 美拉德反應產物的生物學活性在食品中的應用Table 2 Application of biological function of MRPs in foods

4 討論與展望

美拉德反應及其產物能夠有效改善食品的功能特性并使其發揮各種重要的生物學功能，但是對美拉德反應各個階段的反應機理研究還不夠透徹，尤其是高級階段產生的各類未知結構的化合物，而具備某些風味的美拉德反應產物的定向制備（精準合成）是今后研究的方向之一。研究顯示，美拉德反應中可能形成一些有害物物質[85]，如羥甲基賴氨酸可能導致糖尿病和心血管疾病，丙烯酰胺是標準的致癌物質[86]，美拉德反應的高級階段可能導致糖尿病和老年癡呆等疾病[28]。因此，利用美拉德反應復合物作為食品添加劑時，應有效控制反應進程，避免有害物質的生成。另外，隨著人們健康意識的提高，開發出既有獨特風味、又有營養保健功能的產品是消費者的追求。因此，美拉德反應的消化性、毒性，以及抗氧化、抗菌、降血壓、抗腫瘤等生物活性研究成為下一步研究的熱點。