雞柔嫩艾美耳球蟲絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶DNA疫苗免疫保護(hù)效果研究

包夢瑩，鄒志萱，樊慧琴，黃媛媛，王佃云，劉立恒

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌 330045）

危害養(yǎng)雞業(yè)的胞內(nèi)寄生性原蟲病，呈世界范圍分布，發(fā)病率高達(dá)50%～70%，死亡率為20%～30%，嚴(yán)重者可達(dá)80%[1～2]。傳統(tǒng)的抗球蟲藥物和活疫苗控制方法有其自身的局限性和不足[3]。本實(shí)驗(yàn)通過使絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)純化，將DNA苗通過肌肉注射進(jìn)入雞只體內(nèi)，分析結(jié)果，檢測該DNA疫苗的抗柔嫩艾美耳的能力，為新型抗球蟲疫苗的開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康的1日齡海蘭褐蛋公雞，將其飼養(yǎng)在經(jīng)甲醛和高錳酸鉀熏蒸嚴(yán)格消毒，高溫火槍烘烤、高壓水槍沖洗的雞舍，以保證雛雞生活環(huán)境為健康無球蟲環(huán)境。所用飼料中均不含有任何抗球蟲藥物，雞只飼養(yǎng)至14日齡備用。

1.2 基因工程疫苗

pVAX 1.0-絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶DNA，pVAX 1.0-空質(zhì)粒，-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 DNA疫苗質(zhì)粒大量提取與純化

將帶有重組質(zhì)粒的宿主菌取出，取200μL加入到含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中復(fù)蘇過夜。次日繼續(xù)用1000mL新鮮LB培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，12000 rpm離心10min收集沉淀，放入-4℃保存。后采用大提質(zhì)粒法大量提取DNA疫苗（具體流程參考分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)）。

2.2 試驗(yàn)設(shè)計

飼養(yǎng)于無球蟲環(huán)境之中的1日海蘭褐蛋公雞，試驗(yàn)組雞共分為4組，其中每組雛雞30羽，進(jìn)行隨機(jī)分組，分為感染非免疫組（紅對照組，攻蟲，不免疫，注射TE）、非感染非免疫組（白對照組，不攻蟲、不免疫，注射TE）、pVAX 1.0-絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶DNA組（注射DNA疫苗，攻蟲）以及pVAX 1.0-空質(zhì)粒組（注射空質(zhì)粒，攻蟲）。14日齡首免：雞只腿部肌肉注射200μl pVAX -絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶DNA質(zhì)粒/只。紅對照組和白對照組注射同體積TE緩沖液。一周后二免，每只雞腿部肌肉注射200μL pVAX-絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶DNA疫苗。紅對照組和白對照組注射同體積TE緩沖液。二免后第14天，對照組和試驗(yàn)組雞只經(jīng)口接種柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊1×105個/只。在攻蟲后第7天，稱重、撲殺雞只后，取盲腸用于盲腸病變計分和克盲腸卵囊計數(shù)。

3 檢測指標(biāo)

3.1 OPG的計算

按照麥克馬斯特法（McMaster’s method）計算OPG（克腸卵囊值）?？嗣つc內(nèi)容物卵囊減少率（%）=（感染對照組卵囊數(shù)-各組卵囊數(shù)）/感染對照組卵囊數(shù)×100%。

按角田清[4]的方法對盲腸內(nèi)容物中卵囊數(shù)（OPG）與卵囊值進(jìn)行轉(zhuǎn)換。

3.2 存活率

存活率=（試驗(yàn)結(jié)束時存活雞只羽數(shù)/試驗(yàn)組雞只羽數(shù)）×100%

3.3 相對增重率

相對增重率=（試驗(yàn)組增重率/非感染非免疫組增重率）×100%

3.4 抗球蟲指數(shù)（ACI）

ACI=（存活率+相對增重率）-（病變值+卵囊值)

3.5 對小腸進(jìn)行盲腸病變計分

病變值為最終宰殺雞后通過盲腸情況來反映各組實(shí)驗(yàn)對象的病變情況，通過各組實(shí)驗(yàn)對象的病變值來判斷實(shí)驗(yàn)過程中是否發(fā)生交叉感染。

3.6 統(tǒng)計學(xué)分析

試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計分析，采用Student-Newman-Keuls Test進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05為差異顯著具有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)體重增加、存活率、病變評分、卵囊減少率和抗球蟲指數(shù)（ACI）評價pVAX載體-670DNA疫苗的保護(hù)作用。試驗(yàn)證明：雞球蟲的攻毒量，DNA疫苗注射途徑，雞的生長環(huán)境以及其他客觀因素都可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；基因工程疫苗是時代的新方向，是值得深入探究的一個領(lǐng)域，每一次實(shí)驗(yàn)都是一次寶貴的經(jīng)歷；完成動物試驗(yàn)后，可進(jìn)行血清抗原抗體檢測，肌肉蛋白表達(dá)檢測等進(jìn)一步的探索實(shí)驗(yàn)，使實(shí)驗(yàn)更具條理性。見表1。

表1 免疫雞以柔嫩艾美耳球蟲攻蟲后的康球蟲指數(shù)分析

5 討論

根據(jù)本課題所進(jìn)行免疫性保護(hù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，實(shí)驗(yàn)組的存活率相對于其它三組有明顯降低，初步判定實(shí)驗(yàn)組疫苗具有一定的免疫保護(hù)效果。

分析OPG數(shù)據(jù)，可以得出感染非免疫組（紅對照）與免疫試驗(yàn)組卵囊減少效果較為理想。分析病變計分?jǐn)?shù)據(jù)，可得出pVAX-絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶疫苗組病變計分較低，其次是pVAX 1.0-空質(zhì)粒組。分析ACI數(shù)據(jù)，pVAX-絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶疫苗組ACI值為146.99。

綜合以上各試驗(yàn)組數(shù)據(jù)的評價參數(shù)，可以得出pVAX 1.0-SHMTDNA疫苗組在卵囊計數(shù)、相對增重、盲腸病變計分以及ACI指數(shù)方面都有一定效果，對比判定標(biāo)準(zhǔn)可知該DNA疫苗具有良好的免疫保護(hù)效果。