龍膽苦苷對人卵巢癌細胞株A2780/DDP順鉑化療敏感性的影響及機制探討*

井晶，劉夢，郭靜，田二斌

鄭州大學第二附屬醫院，河南 鄭州 450003

卵巢癌是一種高度異質類腫瘤，其發病率位于女性惡性腫瘤第2位，而致死率在女性惡性腫瘤中位居首位［1］。卵巢癌早期無明顯痛感和典型癥狀，不易察覺，因此確診時往往已為中晚期，癌細胞已轉移到腹腔，嚴重威脅女性健康［2］。化療技術是中晚期腫瘤治療的主要手段，以鉑類藥物為基礎的化療方法在卵巢癌的治療中普遍使用［3］。雖然該方法可提高患者5年生存率，但是由于卵巢癌復發率高、易耐藥，使得治療效果不明顯［4］。據報道，90%的卵巢癌晚期患者因多藥耐藥死亡［5］。研究表明，初次化療患者中至少存在20%的患者對鉑類化療藥物具有耐藥性，而在卵巢癌復發患者中，對該藥的耐藥率高達70%以上［6］。因此，如何降低腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性是目前研究的熱點和難點。龍膽苦苷提取自龍膽科植物龍膽，具有抗炎鎮痛、保肝利膽、健胃等功效［7］。研究表明，龍膽苦苷還有抗腫瘤的作用，可抑制卵巢癌細胞增殖、凋亡和遷移［8］。但是該藥物對耐順鉑卵巢癌細胞順鉑化療敏感性的影響尚未涉及，因此，本研究使用龍膽苦苷處理人卵巢癌細胞株A2780/DDP，研究其對順鉑化療敏感性的影響，并探討其機制，為龍膽苦苷在臨床卵巢癌治療中的應用提供理論依據。

1 材料

1.1 細胞人卵巢癌細胞株A2780/DDP（上海美軒生物科技有限公司，貨號C1015112），-80℃恒溫保存，避免反復凍融。

1.2 藥物與試劑順鉑注射液（江蘇豪森藥業集團有限公司，批號：181204）；龍膽苦苷（成都德思特生物技術有限公司，純度≥98%，批號：1808006）。RAMI 1640培養基（美國Gibco公司，批號：20181046）；MTT法細胞增殖分析試劑盒（美國Trevigen公司，批號：1811102）；吉姆薩染色試劑盒（上海歌凡生物科技有限公司，批號：20181016003）；二甲基亞砜（蘇州聯雄化工科技有限公司，批號：20190516）；4%多聚甲醛（上海遠慕生物科技有限公司，批號：201904112）；RNA提取試劑盒（美國賽默飛公司，批號：1904125）；蛋白提取試劑盒（武漢默沙克生物科技有限公司，批號：P1903147）；反轉錄試劑盒（日本Takara公司，批號：190415）；RT-qPCR染色試劑盒（常州百代生物科技有限公司，批號：1902183）；Bcl-2、p53、XIAP、Survivin、p-p53、β-actin一抗和二抗（美國Aviva Systems Biology公司，批號：1904126、1904166、1901118、1904187、1902137、1906132、1905157、1907157、1906128、1908142、1905119、1907135）；TUNEL凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶公司，批號：20181203）；BCA蛋白定量檢測試劑盒（美國Sigma公司，批號：20190812004）；引物合成委托上海賽百盛基因技術有限公司。

1.3 儀器MCO-18AC CO2細胞培養箱（日本SANYO公司）；ELX808酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；Q1000 RT-qPCR儀（杭州朗基科學儀器有限公司）；DY-1000C蛋白電泳設備（南京貝帝試驗儀器有限公司）；CX31型光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；CKX53倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；BD-YG500熒光顯微鏡（廣州博視達光學儀器有限公司）。

2 方法

2.1 細胞培養、分組和干預人卵巢癌細胞株A2780/DDP使用RAMI 1640培養基置于5%CO237℃恒溫細胞培養箱中培養，待細胞生長至對數期，每孔1×105個細胞加入96孔板中，分為對照組、順鉑組、龍膽苦苷組、順鉑+龍膽苦苷組，每組設置6個重復。順鉑組加入5 mg·L-1順鉑，龍膽苦苷組加入15μmol·L-1龍膽苦苷，順鉑+龍膽苦苷組加入15μmol·L-1龍膽苦苷和5 mg·L-1順鉑，對照組給予等體積生理鹽水，培養48 h。

2.2 細胞形態學觀察藥物干預24 h后，將細胞置于光學顯微鏡下觀察細胞形態。

2.3 細胞增殖抑制率檢測分別于藥物干預24 h和48 h后使用MTT法檢測細胞增殖抑制率。每孔加入20μL MTT溶液，置于細胞培養箱中培養4 h后，棄去培養基，每孔加入150μL二甲基亞砜，避光震蕩10 min，使用酶標儀讀取490 nm處光吸收值。

細胞增殖抑制率＝（1-OD實驗組/OD對照組）×100%。

2.4 細胞凋亡指數檢測藥物干預48 h后，按照TUNEL試劑盒說明書檢測細胞凋亡指數。棄去細胞培養基，使用4%多聚甲醛固定細胞2 h，移去固定液，PBS洗3遍，按照TUNEL試劑盒說明書操作加入試劑，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下隨機觀察5個視野中凋亡陽性細胞個數，計算細胞凋亡指數。

細胞凋亡指數＝（細胞凋亡數/細胞總數）×100%

2.5Bcl-2、p53、XIAP、Survivin的mRNA相對表達量檢測采用RT-qPCR檢測Bcl-2、p53、XIAP、Survivin的mRNA相對表達量。藥物干預48 h后，收集細胞至離心管中，加入Trizol試劑，按照RNA提取試劑盒說明書進行細胞總RNA提取，使用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。從NCBI基因庫中查找目的基因mRNA序列并設計出目的基因上下游引物，引物序列見表1。反應條件為：94℃5 min，94℃1 min，56℃30 s，72℃40 s，最后55℃停止。通過配套熒光信號采集系統分析樣品CT值并以β-actin為內參計算各樣品mRNA相對表達量。

表1 引物序列

2.6 Bcl-2、p53、XIAP、Survivin蛋白表達水平及p53磷酸化水平檢測采用Western blot檢測Bcl-2、p53、XIAP、Survivin蛋白表達水平及p53的磷酸化水平。藥物干預48 h后，收集細胞于離心管中，通過蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量檢測試劑盒進行蛋白定量。取40μL樣品上樣，蛋白電泳，轉膜后加封閉液孵育，加一抗（1∶1 000）孵育，加二抗（1∶2 000）孵育，ECL化學發光試劑盒曝光、顯色，掃描成像，以β-actin圖像灰度值為對照，計算各組蛋白相對表達量。

2.7 統計學方法統計結果用均數±標準差（±s）表示，采用SPSS 22.0對實驗數據進行統計學分析。使用單因素方差分析對多組間數據進行比較，使用SNK-q檢驗對數據進行兩兩比較，使用t檢驗對組內數據進行比較。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 龍膽苦苷對A2780/DDP細胞形態的影響對照組A2780/DDP細胞生長狀態良好，細胞排列呈現鋪路石狀，細胞連接緊密且輪廓清晰，偶見死亡懸浮細胞；順鉑組可見少量死亡懸浮細胞，細胞間隙變大，偶見細胞核碎裂；龍膽苦苷組可見部分死亡懸浮細胞，細胞核碎裂較多；順鉑+龍膽苦苷組可見較多細胞處于死亡懸浮狀態，細胞核碎裂嚴重。見圖1。

圖1 A2780/DDP細胞形態學觀察（×200）

3.2 龍膽苦苷對A2780/DDP細胞增殖抑制率的影響與對照組比較，藥物干預24h后，各給藥組A2780/DDP細胞增殖抑制率顯著升高（P＜0.05）；藥物干預48后，各給藥組A2780/DDP細胞增殖抑制率顯著升高，且高于24 h時同組的細胞增殖抑制率（P＜0.05）。藥物干預24 h和48 h后，各組增殖抑制率兩兩比較均表現出：順鉑+龍膽苦苷組＞龍膽苦苷組＞順鉑組＞對照組，且各組間比較均有顯著差異（P＜0.05）。結果見表2。

表2 A2780/DDP細胞增殖抑制率比較 （±s，%）

表2 A2780/DDP細胞增殖抑制率比較 （±s，%）

注：與同組24 h比較，*P＜0.05；與同期對照組比較，a P＜0.05；與同期順鉑+龍膽苦苷組比較，b P＜0.05；與同期龍膽苦苷組比較，c P＜0.05

24 h 48 h對照組組別 n 6 0 0順鉑組 6 19.74±1.28abc 22.15±3.34*abc龍膽苦苷組 6 28.81±2.37ab 31.37±2.66*ab順鉑+龍膽苦苷組 6 34.12±3.84a 45.14±4.90*a

3.3 龍膽苦苷對A2780/DDP細胞凋亡指數的影響采用TUNEL法考察藥物干預48 h后，龍膽苦苷對A2780/DDP細胞凋亡指數的影響。與對照組比較，藥物干預48 h后，A2780/DDP細胞凋亡指數顯著升高（P＜0.05），且順鉑+龍膽苦苷組＞龍膽苦苷組＞順鉑組＞對照組，各組間比較均有顯著差異（P＜0.05）。結果見圖2，表3。

圖2 TUNEL檢測A2780/DDP細胞凋亡（×100）

表3 A2780/DDP細胞凋亡指數（±s，%）

表3 A2780/DDP細胞凋亡指數（±s，%）

注：與對照組比較，a P＜0.05；與順鉑+龍膽苦苷組比較，b P＜0.05；與龍膽苦苷組比較，c P＜0.05

組別 n 細胞凋亡指數對照組5.06±0.52順鉑組 6 19.33±2.38abc龍膽苦苷組 6 36.40±5.31ab順鉑+龍膽苦苷組 6 65.27±10.55 6 a

3.4 龍膽苦苷對A2780/DDP細胞Bcl-2、p53、XIAP、Survivin的mRNA表達的影響與對照組比較，p53 mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05），且順鉑+龍膽苦苷組＞龍膽苦苷組＞順鉑組＞對照組，各組間比較均有顯著差異（P＜0.05）；Bcl-2、XIAP和Survivin的mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05），且對照組＞順鉑組＞龍膽苦苷組＞順鉑+龍膽苦苷組，各組間比較均有顯著差異（P＜0.05）。結果見表4。

表4 A2780/DDP細胞中Bcl-2、p53、XIAP、Survivin的mRNA相對表達量 （±s）

表4 A2780/DDP細胞中Bcl-2、p53、XIAP、Survivin的mRNA相對表達量 （±s）

注：與對照組比較，a P＜0.05；與順鉑+龍膽苦苷組比較，b P＜0.05；與龍膽苦苷組比較，c P＜0.05

mRNA對照組組別 n Bcl-2 mRNA p53 mRNA XIAP mRNA Survivin 6 1.13±0.12 0.74±0.10 0.85±0.14 1.01±0.11順鉑組 6 0.81±0.09abc 1.05±0.12abc 0.64±0.08abc 0.87±0.09abc龍膽苦苷組 6 0.67±0.08ab 1.43±0.11ab 0.49±0.08ab 0.62±0.10ab順鉑+龍膽苦苷組 6 0.55±0.07a 1.79±0.15a 0.33±0.07a 0.45±0.07 a

3.5 龍膽苦苷對A2780/DDP細胞Bcl-2、p53、XIAP、Survivin蛋白表達水平及p53磷酸化水平的影響與對照組比較，p53蛋白表達量和磷酸化水平顯著升高（P＜0.05），且順鉑+龍膽苦苷組＞龍膽苦苷組＞順鉑組＞對照組，各組間比較均有顯著差異（P＜0.05）；Bcl-2、XIAP和Survivin蛋白表達量顯著降低（P＜0.05），且對照組＞順鉑組＞龍膽苦苷組＞順鉑+龍膽苦苷組，各組間比較均有顯著差異（P＜0.05）。見圖3，圖4。

圖3 A2780/DDP細胞中Bcl-2、p53、XIAP、Survivin蛋白表達水平及p53磷酸化水平

圖4 A2780/DDP細胞中Bcl-2、p53、XIAP、Survivin蛋白相對表達水平及p53磷酸化水平

4 討論

隨著我國老齡化日益嚴重，卵巢癌的發病率也逐漸提高［9］。卵巢位于盆腔內，位置隱蔽，發病早期無明顯癥狀，又尚無早期特異性診斷標志物，因此早期難以診斷［10］。未生育、高脂飲食等都是誘發該病的危險因素［11］。目前，化療是中晚期卵巢癌患者治療的重要手段，以順鉑為主的第一代化療藥物具有廣譜抗癌、殺傷力強的特點，廣泛運用于惡性腫瘤的臨床治療［12］。順鉑進入細胞，通過與細胞核中DNA結合從而抑制其轉錄和復制過程，最終誘導細胞凋亡［13］。但是，長期使用順鉑會使腫瘤細胞產生耐藥性，藥效大打折扣。卵巢癌細胞對順鉑的耐藥機制具有多種途徑，阻礙順鉑與DNA結合、干擾細胞凋亡等都是其產生耐藥性的可能機制［14］。因此，尋找加強耐藥細胞對順鉑敏感性的方法，是解決腫瘤細胞耐藥問題的關鍵所在。

龍膽為我國傳統中草藥，具有瀉肝膽火、除下焦濕熱的功效，龍膽苦苷為其主要成分，除保肝利膽，還有抗菌、消炎、止痛、抗腫瘤等功效［15］。研究表明，龍膽苦苷可誘導人肝癌細胞、卵巢癌細胞凋亡［16-17］。本研究使用龍膽苦苷和順鉑作用于對順鉑耐藥的A2780/DDP細胞，24 h后細胞出現了不同程度的形態學改變，其中龍膽苦苷和順鉑聯合用藥組A2780/DDP細胞形態改變最嚴重。細胞增殖抑制率實驗證明，龍膽苦苷可抑制A2780/DDP細胞增殖，并且順鉑+龍膽苦苷組A2780/DDP細胞增殖抑制效果最佳。TUNEL實驗結果再次證實，龍膽苦苷可顯著促進A2780/DDP細胞凋亡，其中順鉑+龍膽苦苷組細胞凋亡指數顯著高于其余各組，表明龍膽苦苷可抑制A2780/DDP細胞增殖，促進細胞凋亡，增強耐藥細胞株A2780/DDP的順鉑敏感性。

順鉑可誘導腫瘤細胞凋亡，但其作用機制尚未完全明確。目前，已知p53、Bcl-2蛋白在順鉑誘導的細胞凋亡中起重要作用［18］。p53為腫瘤抑制蛋白，研究表明，p53基因的激活可誘導腫瘤細胞的凋亡，也是順鉑誘導細胞凋亡的關鍵所在，p53磷酸化水平與其穩定、激活有直接關系［19］。順鉑可激活p53，誘導p53磷酸化，從而發揮其誘導細胞凋亡的功能，而p53基因突變可使卵巢癌細胞株對順鉑的敏感性下降，誘導順鉑耐藥［20］，因此，激活p53是提高順鉑化療敏感性的重要環節。Bcl-2家族蛋白位于線粒體中，對細胞凋亡具有調控作用，其中Bcl-2具有抑制凋亡作用，Bcl-2的過表達可導致細胞存活延長，凋亡抑制［21］。研究表明，順鉑耐藥腫瘤細胞中可觀察到Bcl-2的過表達，而降低Bcl-2表達水平可提高順鉑化療敏感性［22］。XIAP和Survivin屬于凋亡抑制蛋白，對細胞周期、信號傳導、細胞凋亡均有調節作用。凋亡抑制蛋白可以通過阻礙細胞凋亡，促進腫瘤細胞的耐藥性［23］。XIAP的過表達可導致存活因子如caspase-3、caspase-7、caspase-9等蛋白磷酸化并失活，從而阻斷順鉑誘導細胞凋亡。研究表明，順鉑可以抑制敏感細胞株中XIAP蛋白的表達并誘導caspase-3和caspase-9活化，引起細胞凋亡，而耐藥細胞株中XIAP蛋白高表達則細胞對順鉑化療敏感性降低［24］，因此，抑制XIAP基因和蛋白表達可增加癌細胞對順鉑化療的敏感性。Survivin在惡性腫瘤中存在過表達，而正常細胞中表達量極低。研究表明，向人卵巢癌細胞中轉染Survivin基因，誘導Survivin表達量升高，可導致其順鉑耐藥性顯著增加，化療敏感性顯著降低［25］。本 研 究 對A2780/DDP細 胞 株 中p53、Bcl-2、XIAP、Survivin的表達量進行檢測，結果顯示，p53 mRNA和蛋白及其磷酸化水平表達增加而Bcl-2、XIAP、Survivin的mRNA和蛋白表達量均降低，表明龍膽苦苷可通過上調p53表達水平和磷酸化水平，下調Bcl-2、XIAP和Survivin表達水平，增強A2780/DDP細胞株順鉑敏感性，促進A2780/DDP細胞凋亡。

綜上所述，龍膽苦苷可抑制細胞株A2780/DDP增殖、促進腫瘤細胞變形、凋亡，且可增強耐順鉑A2780/DDP細胞對順鉑的敏感性，推測其機制是通過上調p53表達水平及磷酸化水平，下調Bcl-2、XIAP和Survivin表達水平。本研究結果對克服卵巢癌順鉑耐藥性具有臨床意義，但是龍膽苦苷對正常細胞是否具有細胞毒性尚未討論，其臨床應用可行性也尚未涉及，因此有待后續深入研究。