補陽還五湯治療中風的有效成分及作用機制研究*

李東紅，胥芷靈，徐翠珊，賈永艷，3，張運克，2

1.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046；2.河南中醫藥大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450000；3.河南省中藥特色炮制技術工程研究中心，河南 鄭州450046

中風，又稱卒中，始見于張仲景《金匱要略》，是以半身不遂、肌膚不仁、口舌歪斜、言語不利，甚則突然昏仆、不省人事為主要表現的病癥，屬中醫四大疑難病癥之首［1］，相當于現代醫學的急性腦血管疾病，具有高發病率、高病死率、高致殘率、高復發率的特點，嚴重威脅人類健康［2］。歷代醫家對于中風有不同見解。明清時期，王清任認為，其發病機制在于氣虛血瘀，治療需遵循養陰益氣，活血化瘀和疏通經絡。《醫林改錯·論抽風不是風》言：“元氣既虛，必不能達于血管，血管無氣，必停留而瘀。以一氣虛血瘀之癥。”并首次收載了補陽還五湯一方［3-6］。補陽還五湯由黃芪、當歸、赤芍、地龍、川芎、桃仁和紅花7味中藥組成，具有補氣通絡的功效，是中藥方劑中益氣活血的經典方劑，在中風的臨床治療中發揮了極大的作用［7-12］。但是對于補陽還五湯治療中風的有效成分及作用機制尚有待進一步研究。本研究基于網絡藥理學方法，從補陽還五湯所含成分入手，通過TCMSP中藥系統藥理學數據庫與分析平臺預測其靶點，并與中風疾病相關靶點進行對比篩選，使用Cytoscape3.6.0數據可視化軟件制作中藥復方成分-靶標調控網絡圖。通過STRING在線軟件，得到中藥復方-疾病靶標蛋白作用網絡及中藥復方-疾病靶標核心蛋白作用網絡。最后使用Metascape數據庫與微生信在線作圖工具，制作GO富集分析與KEGG通路富集分析氣泡圖，以預測該方劑治療中風的有效成分及作用機制。

1 資料與方法

1.1 補陽還五湯化學成分數據庫的構建通過TCMSP中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索補陽還五湯中7味中藥所含化學成分，以OB（口服生物利用度）值≥30%、DL（類藥性）值≥0.18為篩選條件獲得各個中藥所含化學成分，構建補陽還五湯所含化學成分數據庫。

1.2 靶點預測基于補陽還五湯所含化學成分，通過TCMSP中藥系統藥理學數據庫與分析平臺對該方劑所含化學成分進行化合物-蛋白質作用靶點預測，利用Uniprot蛋白質生物功能數據庫（http：//www.Uniprot.org/），獲得相關基因靶點，矯正蛋白質名稱。

1.3 中風疾病靶點篩選以“Acute cerebrovascular disease”為關鍵詞在GeneCards人類基因數據庫（https：//www.genecards.org/）及OMIM在線人類孟德爾遺傳數據庫（https：//www.omim.org/）中檢索，得到中風疾病靶點。

1.4 中藥復方-疾病靶標的獲取通過1.2項及1.3項獲得補陽還五湯相關作用靶點及中風疾病靶標后，取兩者的靶點基因交集。

1.5 中藥復方成分-靶標調控網絡的構建將1.4項所得中藥復方-疾病靶標與補陽還五湯所含活性成分對應，通過Cytoscape3.6.0數據可視化軟件（http：//cytoscape.org/）處理，得到中藥復方成分-靶標調控網絡。

1.6 PPI網絡的構建與核心靶標的篩選將1.4項中藥復方-疾病靶標導入STRING在線軟件（https：//string-db.org/），選擇人類基因庫，得到補陽還五湯作用于中風的PPI蛋白作用網絡。

1.7 GO富集分析與KEGG通路富集分析將中藥復方-疾病靶標導入Metascape數據庫（https：//metascape.org/gp/index.html），選擇物種為人類，得到基因本體論（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of gene and genome，KEGG）通路富集分析信息。

2 結果

2.1 中藥復方成分-疾病靶標的獲取與調控網絡的構建通過TCMSP中藥系統藥理學數據庫與分析平臺分別尋找補陽還五湯全部活性成分（地龍未收錄，通過查閱文獻［13］，得到其活性成分名稱、結構式、CAS號，通過CAS號在TCMSP數據庫查詢），設置OB≥30%，DL≥0.18，進行初步篩選。并在該數據庫內進行活性成分-蛋白靶點的預測，保留具有蛋白靶點的活性成分。利用Uniprot蛋白質生物功能數據庫（http：//www.Uniprot.org/），獲得相關基因靶點，除去找不到基因靶點的成分，共得到補陽還五湯活性成分63個，相關靶點242個。以“Acute cerebrovascular disease”為關鍵詞在GeneCards人類基因數據庫及OMIM在線人類孟德爾遺傳數據庫中搜索疾病相關靶點信息，整合二者所得數據，得到中風相關疾病靶點1 732個。利用韋恩圖進行分析，取補陽還五湯中所含成分靶點及中風疾病靶點交集，獲得中藥復方-疾病靶標136個，藥物-疾病基因映射率為56.2%，見圖1。將中藥復方-疾病靶標與補陽還五湯所含活性成分對應，得到補陽還五湯治療中風的活性成分20個，見表1。通過Cytoscape3.6.0數據可視化軟件（http：//cytoscape.org/）處理，得到中藥復方成分-靶標調控網絡，見圖2，其中來自黃芪與紅花的共有成分槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol），黃芪與桃仁共有成分常春藤皂苷元（hederagenin），當歸、赤芍、桃仁與紅花共有成分β-谷甾醇（beta-sitosterol）作用尤為明顯。

圖1 補陽還五湯成分靶點-中風疾病靶點韋恩圖

圖2 中藥復方活性成分-疾病靶標調控網絡圖

表1 補陽還五湯作用于中風疾病靶點及對應活性成分

2.2 PPI網絡的構建與核心靶標的篩選將中藥復方-疾病靶標導入STRING在線軟件，選擇人類基因庫，得到中藥復方-疾病靶標蛋白作用網絡，并下載結果文件。將結果文件導入Cytoscape3.6.0數據可視化軟件，進行權重分析，計算degree值，將degree值＞59（二倍中位數）作為篩選依據，得到中藥復方-疾病靶標核心蛋白作用網絡，見圖3。其中核心靶標按照degree值從大到小依次為AKT1、IL-6、ALB、TNF、VEGFA、TP53、CXCL8、PTGS2、CASP3、MAPK8、JUN、EGF、IL-1B、MAPK1、NOS3、MMP9、EGFR、CAT、CCL2、FOS、IL-10、ESR1、MMP2、IL-4。

圖3 中藥復方-疾病靶標蛋白作用網絡及核心蛋白作用網絡圖

2.3 GO富集分析將中藥復方-疾病靶標導入Metascape數據庫，選擇物種為人類，得到基因本體論（GO）富集分析信息，保存文件。以基因數作為篩選依據，GO富集分析選擇前10項，作GO Biological process（BP）、GO Cellular component（CC），GO Molecular function（MF）三合一柱形圖，見圖4。GO富集分析提示，補陽還五湯活性成分主要富集在無機物應答、毒性物質應答、細胞因子介導的信號通路、含氮化合物的纖維素反應、氧化應激反應、纖維素酯、細菌應答、有機環化合物的細胞反應、激素刺激的細胞反應、凋亡信號通路等；在分子組成方面，主要與膜筏、膜微域、膜區、突觸后、突觸膜、軸突、受體復合體、液泡、突觸后膜、突觸前等相關；在分子功能方面，主要涉及蛋白結構域特異性結合、氧化還原酶活性、蛋白質均二聚體活性、蛋白激酶結合、激酶結合、轉錄因子結合、脂質結合、協因子綁定、受體調節活性、近端啟動子序列特異性DNA結合RNA聚合酶Ⅱ等。

圖4 BP、CC、MF三合一柱形圖

2.4 KEGG通路富集分析將中藥復方-疾病靶標導入Metascape，選擇物種為人類，得到京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析信息，保存文件。以基因數作為篩選依據，選擇富集分析信息前20項，見表2。最后用微生信在線作圖工具作KEGG通路富集分析氣泡圖，見圖5。由KEGG通路富集分析信息可知，補陽還五湯治療中風疾病的KEGG通路主要有癌癥通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt信號通路、乙型肝炎病毒、IL-17信號通路、結核病、TNF信號通路、弓形體病、蛋白聚糖在癌癥的作用、恰加斯病（美洲錐蟲病）、MAPK信號通路、細胞凋亡、非酒精性脂肪肝、甲型流感、細胞因子-受體相互作用、百日咳、HTLV-I感染、HIF-1信號通路及直腸癌等。

表2 KEGG通路富集分析信息表

圖5 KEGG通路富集信息氣泡圖

3 討論

本研究基于網絡藥理學理論和方法，使用數據庫及相關工具尋找補陽還五湯活性成分及靶點，篩選補陽還五湯治療中風的活性成分、靶標及核心靶標，構建中藥復方活性成分-疾病靶標調控網絡、中藥復方疾病靶標蛋白作用網絡、中藥復方疾病靶標核心蛋白作用網絡（protein-protein interaction，PPI）及GO、KEGG通路富集分析研究補陽還五湯治療中風的有效成分及作用機制。結果表明補陽還五湯治療中風有效成分20個，其中君藥黃芪與紅花共有成分槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol），黃芪與桃仁共有成分常春藤皂苷元（hederagenin），當歸、赤芍、桃仁與紅花共有成分β-谷甾醇（beta-sitosterol）作用最明顯。其中槲皮素（quercetin）具有抗氧化、清除自由基、抗癌、抗炎、抗菌等生理活性［14-15］，并且具有降血糖、降血壓、降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗血栓和防止冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等多種心血管保護作用［16］；山奈酚（kaempferol）具有抗癌、抗氧化、降血糖、免疫調節、疾病預防、心肌保護、抗慢性腦缺血等藥理作用［17-18］；常春藤皂苷元（hederagenin）具有抗腫瘤、抗抑郁、抗菌抗炎、抗糖尿病、神經保護以及改善高脂血癥血液流變學等藥理作用［19］；β-谷甾醇（beta-sitosterol）具有抗氧化、降低膽固醇、抗炎、抗焦慮及抗驚厥等藥理作用［20］。但是，通過TCMSP數據庫以OB≥30%，DL≥0.18篩選補陽還五湯中活性成分時，君藥黃芪的主要成分黃芪皂苷中大多化合物未通過篩選，所以通過TCMSP數據庫以OB≥30%，DL≥0.18篩選補陽還五湯中活性成分可能會存在某些主要成分的丟失。

中藥復方補陽還五湯治療中風的核心靶點主要有：AKT1、IL-6、ALB、TNF、VEGFA、TP53、CXCL8、PTGS2、CASP3、MAPK8、JUN、EGF、IL-1B、MAPK1、NOS3、MMP9、EGFR、CAT、CCL2、FOS、IL-10、ESR1、MMP2、IL-4。其中AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，研究表明AKT1在血管平滑肌細胞中表達時，在動脈粥樣硬化形成過程中起著關鍵作用，并且可以調節動脈粥樣硬化進展過程中的血管重塑［21］，與腫瘤、心血管、神經系統等疾病發生相關［22-23］；IL-6、TNF、IL-1B、IL-10、IL-4均為重要的炎癥因子，參與調節機體多種炎癥反應［24］，其中IL-6是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的主要炎癥標志物，TNF的亞型TNF-α能夠增加損傷血管中炎性細胞數量，并通過協助血管平滑肌重塑參與動脈粥樣硬化的病理過程；ALB、VEGFA、CXCL8會影響人體血液流變學［25-28］，血清中ALB水平的異常變化可能會引起腦梗死的復發［29］，VEGFA通過與內皮細胞膜上的受體結合，可以調節血管和淋巴管的生成；TP53可以調控細胞分裂與增殖；PTGS2基因的表達產生環氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2），環氧合酶（cyclooxygenase，COX）參與花生四烯酸合成血栓素A2的過程，促進血小板聚集；MMP9和MMP2是細胞外基質重塑的關鍵效應物，MMP2參與神經纖維間質的浸潤和分解過程，與腦組織損傷狀況關系密切［30］。

中藥復方補陽還五湯治療中風的主要通路有癌癥的途徑、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt信號通路、乙型肝炎病毒、IL-17信號通路、結核病、TNF信號通路、弓形體病、蛋白聚糖在癌癥的作用、恰加斯病（美洲錐蟲病）、MAPK信號通路、細胞凋亡、非酒精性脂肪肝、甲型流感、細胞因子-受體相互作用、百日咳、HTLV-I感染、HIF-1信號通路、直腸癌等。研究表明高膽固醇血癥誘發的動脈粥樣硬化可能是通過AGE-RAGE介導的，可溶性晚期糖基化終末產物受體通過與晚期糖基化終末產物受體競爭能抑制動脈粥樣硬化［31］；流體剪切應力和動脈粥樣硬化通路在血脂異常向動脈粥樣硬化發展過程中也發揮著重要作用；流體剪切應力是血液與內皮之間的摩擦力，是決定內皮功能和基因表達的主要因素，可以調整血管通透性［32］；激活PI3K-AktmTOR通路能保護大腦缺血再灌注損傷，具有神經保護功能，可抑制氧化應激相關的神經元自噬［33］；IL-17通路被激活后可以加速血管的動脈粥樣硬化過程［34］；HIF-1信號通路可以調節血脂的代謝。由此可以看出，補陽還五湯治療中風主要通過影響細胞凋亡與再生、改善血液流變學、影響人體代謝水平等方面多通路達到治療效果。

綜上所述，該研究通過對補陽還五湯治療中風的網絡藥理學研究進一步明確了補陽還五湯治療中風的有效成分、靶點及作用機制，這也進一步證明了中藥治療疾病的整體性原則，在發揮治療疾病作用時，將人體作為一個整體，通過多成分-多靶點-多通路達到治療疾病的目的。