基于網絡藥理學和分子對接技術探討芪參益氣滴丸改善心肌缺血再灌注損傷的潛在分子機制*

王建茹，朱明軍，王永霞，彭廣操

河南中醫藥大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450000

《中國心血管病報告2018》顯示，我國心血管病患者多達2.9億，防治心血管病給我國帶來了嚴重的社會和醫療資源負擔［1］。急性心肌梗死（Acute myocardial infarction，AMI）是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的一種急危重表現。近幾十年來，隨著我國經濟的快速發展和生活方式的巨大變化，AMI急劇增加，已成為我國居民住院和死亡的主要原因［2］。早期快速恢復冠狀動脈血流可減少心肌梗死的面積，防止進一步組織損傷。溶栓、經皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）等再灌注策略的發展，極大降低了AMI后短期的病死率，但卻增加了心肌缺血再灌注損傷（myocardium ischemia-reperfusion injury，MIRI）的發病率，加重了心臟結構和功能的損傷，最終可引起多種不良心血管結局［3］。因此，積極發掘有效延緩或逆轉MIRI的措施，具有十分重要的臨床和社會意義，一直是心血管領域研究的重點和熱點。

中藥復方具有多成分、多靶點、多途徑和多效應的特點，在治療疾病方面表現出療效確切、不良反應小的優勢，但其作用機制研究是一直以來的重點和難點［4］?，F階段，研究中藥對某種疾病的作用機制，很難進行系統全面的研究，大多從單靶點或單一通路切入。網絡藥理學因具有整體性和系統性的特點，迎合中醫學的整體觀念，能更好地闡釋中藥復方治療疾病的物質基礎和潛在作用機制，已成為研究中藥的新技術方法，并產生了一系列新的研究數據和成果［5］。分子對接技術作為一種廣泛使用的虛擬篩選方法，可研究小分子配體與受體間的相互作用，預測其結合模式及親和力［6］?，F階段，多項研究均采用網絡藥理學和分子對接技術探討中藥治療某種疾病的物質基礎和作用機制，并確定了這些技術方法的科學性和可行性［7-8］。芪參益氣滴丸包括黃芪、丹參、三七和降香4味藥，具有益氣通脈，活血止痛的作用。目前，芪參益氣滴丸在臨床上已廣泛用于冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心力衰竭、PCI術后心肌損傷等多種心血管疾病的治療，并表現出了良好的臨床應用前景，但其生物分子機制尚需深入的探索研究［9-11］。

基于以上認識，本研究通過網絡藥理學和分子對接技術，揭示芪參益氣滴丸改善MIRI的有效活性成分和潛在分子機制，以期為后續的基礎實驗研究提供新的研究思路，為臨床研究提供一定的客觀依據。

1 資料與方法

1.1 資料中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）數據庫（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）；PubChem數 據 庫（http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；Swiss Target Prediction數據庫（http：//swisstargetprediction.ch/）；GenCLiP 3數據庫（http：//ci.smu.edu.cn/genclip3/analysis.php）；GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）；OMIM數據庫（http：//www.omim.org/）；Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org/）；STRING數 據 庫（https：//string-db.org/）；Veney 2.1軟件；Cytoscape 3.7.2軟件；R 3.6.1軟件；PDB數據庫（http：//www.rcsb.org/pdb/）；PyMOL 2.2.0軟件；ChemBioDraw 2014軟件；Discovery Studio 4.5軟件；Autodock vina1.1.2軟件；Autodock Tools 1.5.6軟件等。

1.2 方法

1.2.1 獲取并篩選芪參益氣滴丸中相關化學成分及作用靶點在TCMSP數據庫中收集芪參益氣滴丸中黃芪、丹參、三七、降香的全部化學成分，收集相應化合物的預測作用靶點?？诜锢枚龋╫ral bioavailability，OB）是藥物成分毒藥物動力學（absorption and distribution and metabolism and excretion，ADME）屬性中最重要的藥動學參數之一，代表口服藥物的有效成分到達人體循環系統的速度和程度，是評價藥物能否發揮藥效的重要指標。類藥性（drug likeness，DL）代表化合物成分與已知化學藥的相似性，對確定中藥成分是否對機體產生活性具有重要參考價值，DL值越高提示化合物的理化性質越穩定，藥動學性質越好。本研究將OB≥30%和DL≥0.18作為條件進行篩選［8，12-14］。同時，在PubChem數據庫中檢索獲取的芪參益氣滴丸所有活性成分的Canonical SMILES結構。然后，在Swiss Target Prediction數據庫對芪參益氣滴丸活性成分的作用靶點進行預測，并以概率≥0.3為閾值進行靶點篩選。

1.2.2 篩選與MIRI相關作用靶點在Gene-Cards、OMIM、GenCLiP 3數據庫中輸入關鍵詞心肌缺血再灌注損傷的英文名稱即“myocardial ischemic reperfusion injury”；“myocardial ischemic-reperfusion injury”；“myocardial ischemia-reperfusion injury”；“myocardial ischemia reperfusion injury”檢索已報道的與MIRI相關的靶點。

1.2.3 獲取芪參益氣滴丸-MIRI共同作用靶點利用Uniprot數據庫對所有作用靶點進行標準化規范。將芪參益氣滴丸中所有活性成分的作用靶點與MIRI相關作用靶點導入Veney 2.1軟件中取交集，獲取芪參益氣滴丸-MIRI共同作用靶點，并繪制韋恩圖。

1.2.4 構建蛋白-蛋白相互作用網絡并篩選核心靶點將1.2.3項下得到的共同靶點上傳至STRING數據庫中，互作得分設置為最高置信度≥0.900，進行蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析，并將結果保存為tsv格式。將導出的tsv文件中的node1、node2和combined score信息導入Cytoscape3.7.2軟件中繪制PPI網絡，用Network Analyzer工具進行網絡分析，利用Generate style from statistics工具對節點大小和顏色進行設置用于反映度值的大小，對邊的粗細進行設置用于反映Combine score的大小。將select選項下Node：degree的最小值設置為平均自由度的2倍，篩選核心靶點，最后選取新的核心PPI網絡。

1.2.5 核心靶點富集分析利用Uniprot數據庫將1.2.4項下篩選出的核心靶點的Uniprot號轉換為entrez號。在R語言的環境下，利用org.Hs.eg.db、clusterProfiler、enrichplot等R程序包對核心靶點進行基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，并繪制條形圖和氣泡圖進行可視化。

1.2.6 中藥-成分-靶標-通路網絡的構建結合已報道的文獻研究，篩選出前30條通路中與MIRI最相關的通路，并找出富集在這些通路上的核心靶點。在Excel表中分別構建芪參益氣滴丸“中藥-活性成分”“活性成分-靶點”“靶點-通路”文件，并將以上文件輸入Cytoscape3.7.2軟件中，構建中藥-成分-靶標-通路網絡。

1.2.7 分子對接將degree排名前5位的核心靶點與其所對應的活性成分進行分子對接。首先，從PDB數據庫中檢索人源核心靶點的PDB號并下載pdb格式的蛋白結構，用PyMOL軟件去除蛋白結構中的水分子、配體等，Auto dock Tools加氫，然后轉換成pdbqt格式。其次，從Chempub數據庫中下載各活性成分的分子結構，保存為SDF格式，再用ChemBio3D進行優化，保存為mol2格式。最后，利用Autodock Vina軟件進行分子對接，獲取結合能值，對接結果采用Discovery Studio Visualizer 4.5和PyMOL軟件進行可視化。結合能數值為負則提示活性成分與核心作用靶點可自由結合，數值越小說明兩者的作用關系越可靠。本研究將＜-5 kcal·mol-1的結合能數值作為閾值，來佐證活性成分與核心靶點之間作用關系的可信度。

2 結果

2.1 芪參益氣滴丸化學成分及其作用靶點在TCMSP數據庫中以OB≥30%、DL≥0.18為條件進行篩選，丹參獲得65個活性成分，黃芪為20個，三七為8個，降香為37個。將這130個活性成分進行匯總剔除重復后共得到125個活性成分。將125個活性成分分別在TCMSP數據庫和Swiss Target Prediction數據庫進行靶點預測，剔除重復項后共獲得350個靶點。

2.2 疾病作用靶點從GeneCards數據庫中檢索到1 275個靶點；OMIM數據庫中檢索到21個靶點；GenCLiP3數據庫中檢索到722個靶點，剔除重復項后共獲得1 475個與MIRI相關的作用靶點。

2.3 藥物-疾病作用靶點的預測將芪參益氣滴丸作用靶點與MIRI相關作用靶點，經過Uniprot數據庫進行標準化后，導入Veney 2.1軟件中取交集并構建韋恩圖（見圖1），最后共獲得181個共同作用靶點，即芪參益氣滴丸潛在改善MIRI的作用靶點。

圖1 芪參益氣滴丸-MIRI靶點韋恩圖

2.4 蛋白相互作用（PPI）網絡的構建與核心靶點的篩選將181個共同靶點導入STRING數據庫中進行蛋白互作關系分析，再使用Cytoscape軟件繪制PPI網絡。該網絡包括157個節點、23 260條邊，平均Degree值為10.561，然后再以平均度值的2倍（22）進行第2次篩選，得到19個節點、342條邊的新的PPI網絡圖，顏色越深、節點越大的圓形靶標節點表示度值越高，說明其在芪參益氣滴丸改善MIRI方面的作用越重要，其中19個節點即是核心作用靶點（見圖2、表1）。

圖2 芪參益氣滴丸改善MIRI共同作用靶點PPI網絡圖

表1 芪參益氣滴丸“藥物-疾病”相互作用網絡中的核心靶點

2.5 核心靶點富集分析在Uniprot數據庫中，將19個核心靶點的Uniprot號轉換為entrez號，然后利用R包進行富集分析。GO功能富集分析結果顯示，依據P≤0.05確定了1 871個GO條目。生物學過程（biological process，BP）條目最多為1 763條，主要涉及DNA結合轉錄因子活性的調控、氧化應激反應等。分子功能（molecular function，MF）條目為77條，主要涉及磷酸酶結合、絲裂原活化蛋白激酶活性等。細胞組分條目（cellular component，CC）為31條，主要涉及核染色質、膜筏等。圖3依據計算出的p.adjust顯著性列舉了3個模塊的前10個條目進行可視化。KEGG通路富集分析結果顯示，依據P≤0.05共映射出了146條信號通路，主要有癌癥相關通路、乙型肝炎、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）信號通路、Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）信號通路等。根據通路所涉及靶點數目和p.adjust的顯著性選取前30條通路，以氣泡圖的形式進行可視化，其中氣泡的大小代表該通路的靶點數目，氣泡顏色代表富集顯著性（見圖4）。

圖3 芪參益氣滴丸改善MIRI潛在核心靶點的GO富集分析條形圖

圖4 芪參益氣滴丸改善MIRI潛在核心靶點的KEGG通路富集分析氣泡圖

2.6 中藥-成分-靶點-通路網絡的構建通過文獻收集，在富集的前30條通路中篩選出了10條可能與MIRI相關的通路，即MAPKs信號通路、腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）信號通路、TLRs信號通路、低氧誘導因子（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信號通路、ErbB信號通路、白細胞介素-17（interleukin-17，IL-17）信號通路、松弛素信號通路、c型凝集素受體信號通路、T細胞受體信號通路、催乳激素信號通路。此外，KEGG富集分析結果中細胞凋亡、磷酸肌醇3激酶（Phosphoinositol 3 kinase，PI3K）-蘇氨酸蛋白激酶（threonine-protein kinases，AKT）信號通路、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路、轉化生長因子-β（transforming growth factor-beta，TGF-β）信號通路、核轉錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）信號通路等雖未據前30位，但卻與MIRI的病理過程密切相關。將這10條通路與芪參益氣滴丸相應的活性成分、作用靶點進行整合，構建中藥-成分-靶標-通路網絡圖（圖5）。如圖5所示，紅色六邊形節點代表芪參益氣滴丸中的中藥，黃色三角形節點代表活性成分，藍色圓形節點代表潛在作用靶點，綠色V節點代表與MIRI密切相關的通路。由圖5可知，芪參益氣滴丸中的黃芪、丹參、三七、降香4味藥中的57個活性成分通過干預19個作用靶點參與以上10條信號通路。

圖5 芪參益氣滴丸的中藥-成分-靶點-通路網絡圖

2.7 分子對接結果為了驗證芪參益氣滴丸“中藥-成分-靶點-通路網絡”的預測結果，將核心作用靶點中度值排名前5位的靶點與其所對應的活性成分進行分子對接，對接的參數設置及相應的計算結果見表2。結果表明，提取出的16對“活性成分-作用靶點”關系中，芪參益氣滴丸的活性成分與5個核心作用靶點均存在不同程度的結合，結合自由能均＜-5 kcal·mol-1，提示篩選出的核心作用靶點與其對應的活性成分具有良好的親和力，說明結果具有一定的可信度。圖6為度值排名第2位的核心作用靶點TP53與其對應活性成分的分子對接結果模擬圖，其中丹參酮IIA與TP53的結合能力最強。

圖6 TP53（1tsr）對接結果模擬圖

表2 活性成分與作用靶點分子對接參數及相應計算結果

3 討論

西醫認為，MIRI的病理過程涉及鈣超載、細胞凋亡、能量代謝障礙、氧化應激以及炎癥反應等［15］。近年來，諸多研究已證實中藥及其復方制劑在改善MIRI方面表現出了明顯的臨床優勢和應用前景，其作用機制主要包括抗炎、抗氧化、抑制鈣超載、改善心肌能量代謝、抑制細胞凋亡等［16］。中醫學并沒有MIRI概念的描述和記載，鑒于MIRI為AMI行PCI術后發生的重要病理過程，且臨床常表現為心功能減退和心梗面積擴大等，故可將MIRI按中醫“胸痹心痛”進行辨證論治。中醫學認為MIRI的病機為本虛標實，且兩者可相兼為病，本虛表現為氣血陰陽的虧虛，標實則以血瘀、痰阻、氣滯、寒凝多見，其中醫辨證分型以氣虛血瘀證最為常見，故可從益氣活血法遣藥組方論治MIRI［17-18］。芪參益氣滴丸作為益氣活血法的代表方劑，可減少PCI術后心血管事件的發生率，減輕患者癥狀，提高其活動能力和生活質量，并被推薦用于冠狀動脈介入術后再狹窄、再發心絞痛和心血管事件的治療以及PCI圍手術期心肌的保護［19-21］。

本研究運用網絡藥理學方法，對芪參益氣滴丸改善MIRI的藥效物質成分和作用機制進行預測分析。結果顯示，芪參益氣滴丸中有125個活性成分分別能與181個藥物-疾病共同靶點發生相互作用，經PPI網絡拓撲分析后共篩選出19個核心作用靶點。同時，利用R程序包對這些核心作用靶點進行GO分析和KEGG分析。富集分析結果顯示，芪參益氣滴丸通過在核染色質、膜筏等部位，調控DNA結合轉錄因子活性、氧化應激反應等生物過程，發揮調節磷酸酶結合、MAP激酶活性等分子功能，達到改善MIRI的作用，涉及的信號通路主要包括MAPKs信號通路、TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、HIF-1信號通路、PI3K-AKT信號通路、mTOR信號通路、TGF-β信號通路、NF-κB信號通路等。利用網絡藥理學所構建的“中藥-成分-靶點-通路”網絡顯示，芪參益氣滴丸的不同活性成分可對應同一個靶點，同時一個活性成分也可分別對應多個靶點，繼而引發不同的生物學效應，這表明芪參益氣滴丸在改善MIRI方面，表現出了多成分、多靶點、多效應的特點。分子對接結果顯示，5個核心作用靶點和8個活性成分，共構成了16組對接關系對，關系對間親和力良好，對接體系穩定。這些結果提示，芪參益氣滴丸所含的活性成分具有調控MIRI相關靶點的生物活性，從側面佐證了網絡藥理學預測結果的科學性和可靠性。

研究顯示，芪參益氣滴丸的多種活性成分可通過調控自噬相關通路改善MIRI，比如丹參素通過上調mTOR信號通路對MIRI發揮保護作用［22］；丹酚酸B防治MIRI的作用機制與PI3K/AKT信號通路調控的自噬有關［23］；人參皂苷Rg1通過激活PI3K/AKT/mTOR通 路 上 調HIF-1α改 善MIRI［24］。MAPKs信號通路介導MIRI病理，而芪參益氣滴丸所含的活性成分黃芪多糖和丹參素，可分別通過下調p38MAPK信號通路，抑制p-JNK的活性來改善MIRI［25-26］。有研究報道，芪參益氣滴丸的大量活性成分具有抗氧化應激的作用，可通過調控PI3K/AKT信號通路的表達水平和活性，拮抗MIRI導致的細胞凋亡；還可降低MIRI過程中TNF-α、IL-1β、TLR4、NF-κB等炎性因子的表達［27-28］。此外，芪參益氣滴丸能通過抑制MIRI誘導的TGFβ信號通路的激活，改善其導致的心肌纖維化程度［29］。上述其他學者的研究結果與本研究所預測的芪參益氣滴丸改善MIRI作用機制的部分結果相一致，這充分說明本次研究結果的可靠性和準確性。

綜上所述，芪參益氣滴丸改善MIRI是多靶點、多途徑的復雜過程，本次研究結果為進一步探討芪參益氣滴丸改善MIRI的藥效物質基礎和作用機制提供了可能的研究方向。但由于TCMSP數據庫和疾病數據庫的不完善以及網絡藥理學研究自身局限性等因素的影響，本研究結果尚不能完全闡釋芪參益氣滴丸改善MIRI的生物學基礎，仍需后續基礎實驗和臨床試驗研究的觀察與佐證。