基于JAK-STAT通路研究槲皮素對人宮頸癌C-33A細胞的影響*

王慧玲，趙維楠，羅瑞，崔平平，郭瑞霞

1.許昌市第二人民醫院，河南 許昌 461000；2.許昌市中心醫院，河南 許昌 461000

宮頸癌是婦科常見惡性腫瘤之一，在常見惡性腫瘤中居第四位，嚴重危害患者身心健康［1］。近年來，我國宮頸癌病死率明顯增加，同時患病人群趨向年輕化［2］。目前，臨床上治療宮頸癌主要以手術為主，配合放療、化療等，但其引起的創傷和不良反應較為嚴重，影響患者的生活質量［3］。槲皮素是黃酮類化合物，廣泛存在松針、槐米、菟絲子等植物的葉、花及果實中，具有較高藥用價值［4］，有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、免疫抑制、保護心血管等作用。近年來發現，槲皮素對多種腫瘤細胞增殖有抑制作用［5-6］。本研究通過觀察槲皮素對人宮頸癌C-33A細胞增殖、凋亡及細胞周期的影響，旨在明確其對C-33A細胞的作用機制，以期為臨床槲皮素藥物的開發及宮頸癌的有效治療提供理論參考。

1 材料

1.1 細胞系人宮頸癌C-33A細胞（美國ATCC公司，貨號：YB-ATCC-9284）。

1.2 藥物與試劑槲皮素（含量≥95%，貨號：Q4951-10G）、噻唑藍（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）試劑（貨號：M2128-1G）、二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）（貨號：D5879）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（貨號：10099-141）、Annexin V-異硫氰酸熒光素（flourescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）細胞凋亡檢測試劑盒（貨號：C1062S）、兔抗人蛋白酪氨酸激酶2（janus kinase 2，JAK2）抗體（貨號：ab108596）、p-JAK2抗體（貨號：ab219728）、信號傳導及轉錄活化因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）抗體（貨號：ab68153）、p-STAT3抗體（貨號：ab267373）、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體（貨號：ab6721）均購自美國Abcam公司。

1.3 儀器TE2000-U型倒置生物顯微鏡（日本Nikon公司）；TY1218型FACSCalibu流式細胞儀（美國BD公司）；Multiskan GO型全波長酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；1658033型垂直電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 細胞培養取常規凍存復蘇的人宮頸癌C-33A細胞，接種于含10%FBS、100 U·mL-1青霉素及100 mg·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養基中，置于5%CO2培養箱，37℃培養。2～3 d傳代一次，取對數生長期細胞用于實驗。

2.2 細胞藥物處理及分組用DMSO將槲皮素配制成1 mmol·L-1濃度的母液，-20℃保存備用；實驗時用RPMI 1640培養基稀釋槲皮素母液，使培養基中槲皮素濃度分別為20μmol·L-1、40μmol·L-1、80μmol·L-1，DMSO最終濃度＜0.1%。將對數生長期的人宮頸癌C-33A細胞分為對照組（DMSO）、20μmol·L-1組（DMSO+20μmol·L-1槲皮素）、40μmol·L-1組（DMSO+40μmol·L-1槲皮素）、80μmol·L-1組（DMSO+80μmol·L-1槲皮素）。

2.3 檢測細胞抑制率取對數期細胞，PBS沖洗，胰酶消化5 min，加入RPMI 1640培養基調節細胞密度為105mL-1，接種于96孔板。細胞貼壁后，對照組、20μmol·L-1組、40μmol·L-1組、80μmol·L-1組更換相對應的培養基，每孔200μL，分別培養24 h、48 h、72 h。在各時間段結束前4 h按每孔20μL加入5 g·L-1MTT溶液，孵育4 h，每孔加入150μL DMSO，充分震蕩10 min，用酶標儀于490 nm測定各孔的光密度（A）值，每組每個時間點均設置5個復孔，計算抑制率。

抑制率（%）＝（對照孔A值-用藥孔A值）/對照孔A值×100%

2.4 檢測細胞凋亡情況取對數期細胞經胰酶消化后，調節細胞密度為106mL-1，接種于6孔板，細胞貼壁后，分別更換為相對應的培養基，常規培養48 h。胰酶消化后收集各組細胞，室溫2 000 r·min-1離心5 min（離心半徑10 cm），棄去上清，加4℃PBS漂洗，加入195μL Binding buffer重懸細胞，加入5μL AnnexinV-FITC 4℃避光孵育15 min，加入10μL PI染色5 min，置于流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。每組均設置5個復孔。

2.5 細胞周期的檢測將各組細胞經胰酶消化后，按5×105mL-1接種于6孔板，細胞貼壁后，分別更換相對應的培養基，培養48 h后，用胰酶消化后收集各組細胞，1 000 r·min-1離心5 min（離心半徑10 cm），用預冷PBS漂洗2次后，加入70%預冷的乙醇，4℃固定過夜，1 000 r·min-1離心5 min（離心半徑10 cm），PBS漂洗2次，用核糖核酸酶消化30 min，用PI染液避光染色30 min，使用流式細胞儀進行細胞周期檢測。每組均設置5個復孔。

2.6 檢測細胞中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達取對數期細胞，調節密度為106mL-1接種于培養瓶中，細胞貼壁后各組更換相對應的培養基，培養48 h后，收集細胞，提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，每孔加入蛋白樣品40μL，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉至PVDF膜上，TBST溶液洗膜3次，10 min/次，用5%脫脂奶粉孵育1 h，加入1∶1 000稀釋的JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、β-actin一抗，4℃搖床孵育過夜，TBST溶液洗膜3次，每次10 min，加入1∶4 000相應的辣根過氧化物酶標記的二抗，搖床室溫孵育2 h。TBST溶液洗膜3次，每次10 min，加入ECL超敏發光液，應用凝膠成像系統顯影、定影，分析條帶結果。

2.7 統計學方法采用SPSS 24.0統計學軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 槲皮素對細胞增殖的影響與20μmol·L-1組比較，40μmol·L-1組、80μmol·L-1組的24 h、48 h、72 h抑制率均升高（P＜0.05），且80μmol·L-1組各時間抑制率明顯高于40μmol·L-1組（P＜0.05）。20μmol·L-1組、40μmol·L-1組、80μmol·L-1組抑制率均隨時間延長而增加（P＜0.05）。見表1。

表1 槲皮素對細胞增殖的影響 （±s，n＝5，%）

表1 槲皮素對細胞增殖的影響 （±s，n＝5，%）

注：與20μmol·L-1組比較，*P＜0.05；與40μmol·L-1組比較，△P＜0.05；與24 h抑制率比較，a P＜0.05；與48 h抑制率比較，b P＜0.05

抑制率20μmol·L-1組 16.52±1.76 33.21±3.64a 42.61±4.57ab組別 24 h抑制率 48 h抑制率 72 h 40μmol·L-1組 27.98±2.94*45.68±4.87*a 53.82±5.61*ab 80μmol·L-1組 35.74±3.75*△54.19±5.68*△a 64.57±6.75*△ab

3.2 細胞凋亡率比較與對照組比較，20μmol·L-1組、40μmol·L-1組、80μmol·L-1組細胞凋亡率均升高（P＜0.05）；與20μmol·L-1組比較，40μmol·L-1組、80μmol·L-1組細胞凋亡率均升高（P＜0.05）；80μmol·L-1組細胞凋亡率高于40μmol·L-1組（P＜0.05）。見圖1。

圖1 槲皮素對細胞增殖的影響

3.3 槲皮素對細胞周期的影響與對照組比較，20μmol·L-1組、40μmol·L-1組、80μmol·L-1組G1期細胞百分率均升高，S期、G2/M期細胞百分率均降低（P＜0.05）；與20μmol·L-1組比較，40μmol·L-1組、80μmol·L-1組G1期細胞百分率均升高，S期、G2/M期細胞百分率均降低（P＜0.05）；80μmol·L-1組G1期細胞百分率高于40μmol·L-1組，S期、G2/M期細胞百分率低于40μmol·L-1組（P＜0.05）。見表2，圖2。

表2 槲皮素對細胞周期的影響 （±s，n＝5，%）

表2 槲皮素對細胞周期的影響 （±s，n＝5，%）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與20μmol·L-1組比較，△P＜0.05；與40μmol·L-1組比較，◇P＜0.05

組別 G1期 S期 G2/M期45.23±5.16 24.37±2.57 29.61±2.84 20μmol·L-1組53.46±5.73* 20.13±2.64* 25.36±2.57*40μmol·L-1組62.51±6.79*△16.49±1.82*△ 20.82±2.03*△80μmol·L-1組73.16±7.35*△◇13.18±1.68*△◇15.47±1.72對照組*△◇

圖2 槲皮素對細胞周期的影響

3.4 槲皮素對細胞中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平的影響與對照組比較，20μmol·L-1組、40μmol·L-1組、80μmol·L-1組p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平明顯降低（P＜0.05）；與20μmol·L-1組比較，40μmol·L-1組、80μmol·L-1組p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平均降低（P＜0.05）；80μmol·L-1組p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平低于40μmol·L-1組（P＜0.05）。見表3，圖3。

表3 細胞中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平比較 （±s，n＝5）

表3 細胞中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平比較 （±s，n＝5）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與20μmol·L-1組比較，△P＜0.05；與40μmol·L-1組比較，◇P＜0.05

p-JAK2/JAK2 p-STAT3/STAT3對照組組別0.92±0.09 0.96±0.10 20μmol·L-1組 0.80±0.07* 0.70±0.07*40μmol·L-1組 0.60±0.05*△ 0.59±0.05*△80μmol·L-1組 0.45±0.04*△◇ 0.51±0.05*△◇

圖3 各組細胞JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達

4 討論

宮頸癌嚴重危害女性身體健康，其病因復雜，國內外流行病學及實驗研究表明，感染人乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是宮頸癌發病的主要病因，尤其是高危型HPV持續感染是宮頸癌發病的主要危險因素之一［7-8］。目前宮頸癌的治療手段較多，傳統手術及放化療方式治療宮頸癌存在較多不良反應，長期化療易引起肝腎毒性、神經毒性、骨髓抑制等，因此治療宮頸癌應合理采用多種治療方式相結合，對提高患者的治療效果、改善預后及減少不良反應等有重要意義［9-10］。研究發現，多種中藥的活性成分具有抑制癌細胞增殖、誘導癌細胞凋亡的作用［11-13］。臨床上使用中藥治療惡性腫瘤，具有廣闊的應用前景。

腫瘤細胞顯著特點是失控性和無限性，細胞增殖和凋亡在正常情況下保持著動態平衡，以維持生物自身穩定性，細胞增殖失控或者凋亡受阻都可導致腫瘤的發生［14-15］。細胞周期是細胞從上一次分裂完成開始到下一次分裂結束的整個過程，包括有絲分裂期（M期）和分裂間期（G1期、S期、G2期），細胞周期阻滯可減慢細胞增殖速度，誘導細胞凋亡［16-17］。體外實驗證明，槲皮素可抑制胰腺癌、肝癌、結直腸癌等多種惡性腫瘤細胞增殖，并誘導細胞凋亡，對腫瘤細胞發揮抑制作用［18-20］。體內實驗研究顯示，槲皮素可降低結直腸癌小鼠死亡率［21］。Liu等［22］研究顯示，槲皮素可增加順鉑對乳腺癌荷瘤小鼠抗腫瘤敏感性，可作為化療佐劑發揮抗腫瘤作用。另外，槲皮素具有影響腫瘤細胞周期分布的作用，并可誘導三陰性乳腺癌細胞周期阻滯［23-24］。槲皮素具有明顯抗腫瘤活性，但其在宮頸癌中相關報道較少。本研究使用不同濃度槲皮素作用于宮頸癌C-33A細胞，結果顯示，各濃度槲皮素組較對照組抑制率、凋亡率及G1期細胞百分率明顯升高，S期和G2/M期細胞百分率明顯降低，提示槲皮素可抑制C-33A細胞增殖，促進細胞凋亡，阻斷細胞由G1期向S期轉換，誘導周期阻滯，發揮抑制增殖、誘導凋亡及細胞周期阻滯作用。

JAK2/STAT3通路與細胞生長、分化和凋亡等過程關系密切。多種細胞因子可激活JAK2，JAK2磷酸化后激活下游STAT3活化為p-STAT3，使JAK2/STAT3信號通路持續活化，促進下游調控基因過表達，誘導腫瘤細胞形成、轉化、浸潤、遷移等，介導腫瘤發生發展過程［25-26］。研究顯示，STAT3在卵巢癌、結直腸癌等多種腫瘤細胞中表達異常，阻斷STAT3表達可抑制腫瘤細胞的增殖，誘導腫瘤細胞凋亡［27-28］。Lu等［29］研究表明，抑制JAK2/STAT3通路，可誘導人食道鱗狀細胞癌細胞凋亡。Huang等［30］研究表明，抑制JAK2/STAT3通路可誘導骨肉瘤細胞G0/G1期阻滯促進其凋亡，抑制細胞侵襲。本研究發現，各濃度槲皮素組較對照組p-JAK2、p-STAT3蛋白表達明顯下降，表明槲皮素可能參與調控JAK2/STAT3通路的激活。

綜上所述，槲皮素能抑制人宮頸癌C-33A細胞增殖，誘導細胞凋亡及細胞周期阻滯，其機制可能是通過阻斷JAK2/STAT3通路，為臨床槲皮素藥物的開發及宮頸癌的治療提供一定理論參考。