恩諾沙星乳在羅非魚體內的藥代動力學及組織分布

朱曉漫，劉永濤，楊秋紅，胥 寧，劉紹春，董 靖，宋 懌，艾曉輝

(1.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306；2.中國水產科學研究院長江水產研究所，武漢 430223；3.中國水產科學研究院 農業農村部水產品質量安全控制重點實驗室，武漢 430223；4.岳陽漁美康生物科技有限公司，湖南岳陽 414199)

恩諾沙星(enrofloxacin,ENR)是一種氟喹諾酮類動物專用抗菌藥，具有廣譜殺菌性，在養殖魚類中被廣泛應用于由嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)[1]、大腸桿菌(Escherichiacoli)、維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)[2]及粘球菌(Myxococcuspiscicola)[3]等引起的病癥，其代謝產物為環丙沙星(ciprofloxacin,CIP)。國內外已有較多有關恩諾沙星在水生動物體內藥代動力學方面的研究報道，Koc等[4]分析了口服和靜脈給藥10 mg/kg恩諾沙星在褐鱒體內的藥代動力學，達峰時間(Tmax)為8 h，峰濃度(Cmax)為(2.30±0.08)μg/mL；Zhai等[5]研究了恩諾沙星在脊尾白蝦體內的藥代動力學；Kim等[6]研究了恩諾沙星在鯰體內的藥代動力學。施建中[7]、徐維海等[8]研究了恩諾沙星在羅非魚體內的殘留消除規律，但恩諾沙星在羅非魚(Oreochromsmossambcus)體內的藥代動力學研究尚未見報道；恩諾沙星乳作為一種近年來開發的新劑型，國內外尚未展開其在水產動物體內的藥代動力學研究。羅非魚是聯合國糧農組織推廣養殖的品種之一，為我國重要的出口創匯水產品，無乳鏈球菌病是危害羅非魚最嚴重的疾病之一，該菌在羅非魚腦組織中分布量較多，因常規抗菌藥物難以穿透血腦屏障，目前尚無好的防治藥物[9]。本試驗采用本實驗室研制的恩諾沙星乳新劑型，研究了口灌給藥方式下恩諾沙星乳在羅非魚體內的藥代動力學及其在各組織的分布規律，旨在為羅非魚養殖過程中合理使用恩諾沙星乳提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試驗用魚與養殖條件

健康羅非魚96尾，由中國水產科學研究院長江水產研究所基地提供，平均體重為(100±20)g。試驗前在玻璃水族箱(規格為1 m×0.6 m，水深0.5 m)中暫養一周。試驗用水為充分曝氣自來水，養殖和試驗過程中水體持續充氧，保持水中溶氧大于 5.0 mg/L，pH為7.5～8.0，溫度恒定在(30±1)℃。

1.1.2 儀器設備

實驗中使用的主要儀器包括:Waters Acquity超高效液相色譜儀(Binary Solvent Manager、 Sample Manager、 FLR Detector、 配Empower色譜工作站，美國Waters公司)；精密電子天平(AE-240， METTLE-TOLEDO公司)；高速冷凍離心機； 氮吹儀(KD200，杭州奧盛儀器有限公司)；濃配罐(100L，宜興市江益環保有限公司)；渦旋混合器(HQ-60-IV，北方同正)；超聲波清洗器(KQ2200DE，昆山市超聲儀器有限公司)等。

1.1.3 藥品與試劑

恩諾沙星標準品(純度>99.0%,Dr.Ehrenstorfer GmbH)，環丙沙星標準品(純度>95.0%,Dr.Ehrenstorfer GmbH)，恩諾沙星乳(無色至淡黃色液體，規格5 g：100 mL，恩諾沙星乳滴呈球形，平均粒徑為(18.23±5.022) nm，山東魯抗醫藥股份有限公司GMP車間中試生產，批號：1711001)，乙腈、正己烷、水(色譜純，美國CNW公司)，甲酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)無水硫酸鎂(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)，肝素鈉(源葉生物)。

1.2 實驗方法

1.2.1 恩諾沙星乳藥液的配制

首先將表面活性劑聚氧乙烯蓖麻油-40和助表面活性劑乙酸在濃配罐內攪拌混勻，然后加入油相肉豆蔻酸異丙酯和恩諾沙星原藥，繼續攪拌混勻，最后加入去離子水，繼續攪拌直至體系變得澄澈透明，即形成恩諾沙星乳劑。制備出的恩諾沙星乳質量濃度為5%，用蒸餾水將恩諾沙星乳稀釋10倍，所得藥液的恩諾沙星含量為5 mg/mL。

1.2.2 口灌給藥和樣品采集

羅非魚開始實驗前停食24 h，隨機抽取6尾作為空白對照，確定空白樣品無恩諾沙星和環丙沙星殘留后，以10 mg/kg 劑量對羅非魚單次口灌恩諾沙星乳。分別在給藥后的0.5、1、2、4、6、8、12、18、24、48、72、96、120、144、168 h采集血漿(抽取血液轉移至1%肝素鈉處理的離心管，輕輕轉動離心管后4 000 r/min離心5 min，取上清)，同時采集肌肉、肝臟、腎臟和腦組織，每個采樣點設定6尾魚為平行樣，-20 ℃貯存待測。

1.2.3 樣品前處理

在室溫下，將冷凍樣品自然解凍。準確量取血漿0.5 mL于10 mL離心管中，加入4 mL酸化乙腈(乙腈 ∶鹽酸 ∶水=250 ∶1 ∶1)，渦旋震蕩30 s，加入0.5 g無水硫酸鎂，渦旋震蕩30 s，7 000 r/min離心5 min，取上清液于另一10 mL離心管中。剩余殘渣再加入4 mL酸化乙腈，重復提取一遍，合并上清液。50 ℃氮氣吹干，1 mL流動相(0.2%甲酸水∶乙腈=82∶18)復溶，加入1 mL 正己烷旋渦混合30 s去脂，7 000 r/min離心5 min，取1 mL下層溶液過0.22 μm有機濾膜，供超高效液相色譜儀分析測定[10]。

稱取肌肉和肝臟樣品1 g，以及全部的腎臟和腦組織樣品于15 mL離心管中，加入6 mL酸化乙腈(乙腈∶鹽酸∶水=250∶1∶1)，渦旋震蕩30 s，加入0.5 g無水硫酸鎂，渦旋震蕩30 s，7 000 r/min離心5 min，取上清液于10 mL離心管中。剩余殘渣再加入6 mL酸化乙腈，重復提取一遍，合并上清液。50 ℃氮氣吹干，2 mL流動相復溶，加入2 mL 正己烷旋渦混合30 s去脂，7 000 r/min離心5 min，取1 mL下層溶液過0.22 μm有機濾膜，供超高效液相色譜儀分析測定[10]。

1.3 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLCTM BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，17 μm)，柱溫30 ℃；流動相：0.2%甲酸水(0.2%甲酸+99.8%水)∶乙腈=82∶18，流速0.3 mL/min；激發波長280 nm，發射波長450 nm；進樣量：3 μL。

1.4 標準溶液的配制和標準曲線的制備

精確稱取恩諾沙星、環丙沙星各10 mg，分別用乙腈溶解后定容至100 mL，配制成濃度為100 μg/mL的恩諾沙星和環丙沙星的標準品母液，4 ℃避光保存備用。用流動相將恩諾沙星和環丙沙星標準品母液依次稀釋至10、50、100、500、1 000、2 000 μg/L，用超高效液相色譜檢測。以標準品濃度作為橫坐標(X軸)、峰面積為縱坐標(Y軸)繪制標準曲線，計算回歸方程及相關系數。

1.5 方法回收率與檢測限

取羅非魚各組織的空白樣品，分別加入10、50、100 μg/kg恩諾沙星和環丙沙星標準品，放置30 min，以“樣品前處理”方法進行處理后進行超高效液相色譜檢測，每個濃度3個平行，得到樣品實測濃度，計算回收率和相對標準偏差(RSD)。以引起3倍基線噪音的藥量的質量濃度作為最低檢測限。

1.6 數據處理

標準曲線以及恩諾沙星、環丙沙星的藥-時曲線用Microsoft Excel 2010進行計算和繪制；采用WinNonlin軟件進行恩諾沙星和環丙沙星的藥代動力學分析。

2 結果

2.1 標準曲線與方法回收率

在本實驗方法條件下，恩諾沙星和環丙沙星在10～2000 μg/L的濃度范圍內具有良好的線性關系，以 恩諾沙星和環丙沙星峰面積為縱坐標(Y軸)，以化合物的質量濃度為橫坐標(X軸)，繪制得到的標準曲線方程分別為Y=2283.1X+5504.5和Y=1268.3X+5132.6，相關系數R2均大于0.999。在本實驗條件下，恩諾沙星和環丙沙星最低檢測限為2 μg/L，定量限為10 μg/L。如表1所示，恩諾沙星和環丙沙星在各組織中的平均回收率為75.21%～108.77%，RSD<10%，滿足分析方法要求。

表1 恩諾沙星和環丙沙星在羅非魚各組織中的回收率

2.2 恩諾沙星乳在羅非魚血漿中的藥代動力學特征

所得恩諾沙星乳在羅非魚各組織中的藥代動力學參數見表2。結果顯示：血漿中恩諾沙星在2 h的藥物峰濃度Cmax為4.38 mg/L、消除速率常數ke值為0.02 h-1、藥時曲線下面積AUC為106.11(mg/L)·h；血漿中環丙沙星在8 h的Cmax為0.1 mg/L、ke值為0.01 h-1、藥時曲線下面積AUC為5.35(mg/L)·h。

表2 羅非魚單次口灌恩諾沙星乳后血漿中恩諾沙星和環丙沙星的藥代動力學參數

2.3 恩諾沙星乳在羅非魚腦、肌肉、肝臟和腎臟中的吸收與分布

如圖1所示，單次口灌10 mg/kg恩諾沙星乳后，恩諾沙星在腦中的代謝規律與血漿基本一致，在給藥結束后2 h含量到達峰值4.38 mg/L(血漿)、4.31 mg/kg(腦)，隨后在2～24 h內濃度迅速下降，24 h之后下降速率減緩，72 h后趨于平穩。肌肉中的恩諾沙星略高于血漿和腦，在給藥結束后4 h含量到達峰值6.22 mg/kg。肝臟中，恩諾沙星在給藥結束后1 h藥物濃度到達峰值12.37 mg/kg，高于其他組織，之后在24 h內恩諾沙星濃度迅速下降但仍保持一個較高的濃度水平，達到3.0 mg/kg以上。腎臟中的恩諾沙星濃度達峰時間較其他組織晚，在6 h到達峰值7.82 mg/kg，6 h之后組織中藥物濃度下降速率也比其他組織平緩，且之后各時間點的濃度均高于其他組織。

圖1 單次口灌10 mg/kg恩諾沙星乳在羅非魚各組織的藥-時曲線

羅非魚單次口灌10 mg/kg 恩諾沙星乳后，各組織中恩諾沙星的消除方程及參數見表3。各組織中恩諾沙星的消除半衰期T1/2為腎﹥腦﹥肌肉﹥肝、藥物平均駐留時間MRT為腎﹥腦﹥肝﹥肌肉、藥時曲線下面積AUC為腎﹥肝﹥肌肉﹥腦。

表3 羅非魚單次口灌恩諾沙星乳后各組織的消除方程及參數

2.4 環丙沙星在羅非魚體內的分布

通過檢測環丙沙星和恩諾沙星在羅非魚體內的含量，對數據進行統計和分析發現，血漿中環丙沙星占恩諾沙星的百分比約為4.68%、肌肉中約為3.97%、肝臟中約為6.03%、腎臟中約為3.22%。環丙沙星在血漿、肌肉、肝和腎中有檢出，Tmax分別為8、6、4和6 h，Cmax分別為0.1 mg/L、0.39、0.15和0.23 mg/kg(見圖2)。單劑量10 mg/kg口灌恩諾沙星后，其主要代謝物環丙沙星在羅非魚各組織的分布為肝﹥腎﹥肌肉﹥血漿，與恩諾沙星在羅非魚各組織中的分布情況一致。給藥后168 h，血漿和肌肉中的環丙沙星下降到0.01 mg/kg以下，肝臟和腎臟中的環丙沙星下降到0.02 mg/kg以下。

圖2 單次口灌10 mg/kg恩諾沙星乳后環丙沙星在羅非魚體內的分布

羅非魚單次口灌10 mg/kg 恩諾沙星乳后，其主要代謝產物環丙沙星的消除方程及參數見表4。各組織中環丙沙星的消除半衰期T1/2為腎﹥肝﹥肌肉、藥物平均駐留時間MRT為肝﹥腎﹥肌肉、藥時曲線下面積AUC為腎﹥肝﹥肌肉。

表4 單次口灌后羅非魚各組織環丙沙星的消除方程及參數

3 討論

3.1 恩諾沙星乳在羅非魚體內的代謝規律

本實驗條件下，恩諾沙星在羅非魚血漿、肌肉、肝臟、腎臟和腦的Tmax分別為2、4、1、6和2 h，Cmax分別為4.38、6.22、12.37、7.82和4.31 mg/kg，AUC為106.11(mg/L)·h、159.02、250.42、392.71和103.14(mg/kg)·h。研究顯示，單劑量口服或口灌10 mg/kg恩諾沙星，鯽血漿在0.5 h的Cmax為3.55 mg/L[11]；大黃魚血漿在7.67 h的Cmax為3.59 mg/L[12]。恩諾沙星乳在羅非魚血漿中的藥物峰濃度均高于鯽和大黃魚，羅非魚對恩諾沙星的吸收速度比大黃魚快，比鯽慢。恩諾沙星在羅非魚肝臟中最快達到藥物峰濃度，且峰濃度最高，這可能是由于肝臟中含有多種藥物代謝酶，是魚類藥物和毒物代謝的最主要器官。恩諾沙星在羅非魚腎臟中消除最慢、T1/2和MRT最長、AUC最大，藥物濃度在到達峰值之后就一直高于其他組織，恩諾沙星總吸收量最高，這是因為在恩諾沙星不斷經過腎臟隨著尿液排出的過程，其他組織中的一部分恩諾沙星會被運輸到腎臟，從而導致恩諾沙星在腎臟中的蓄積。由此可見，肝臟和腎臟是羅非魚代謝恩諾沙星的主要器官，對于恩諾沙星在羅非魚體內的代謝和消除具有重要作用。恩諾沙星在腦組織中總吸收量較低，但T1/2和MRT都比較長，說明其在腦組織比在其他組織難代謝和消除，這可能是因為腦作為一個高度分化的器官，其中代謝藥物的酶較少。

3.2 恩諾沙星的主要代謝產物環丙沙星在羅非魚體內的代謝規律

恩諾沙星在魚體內的主要代謝產物是環丙沙星，環丙沙星在羅非魚血漿、肌肉、肝臟和腎臟的Tmax為8、6、4和6 h，Cmax為0.1 mg/L、0.39、0.15和0.23 mg/kg，AUC為5.35(mg/L)·h、6.5、14.99和15.83(mg/kg)·h。由數據可知，環丙沙星在血漿中的吸收和消除都比恩諾沙星慢，且濃度遠低于恩諾沙星。在水產動物體內，大部分恩諾沙星都以原藥形式代謝出體外[13]。本實驗中環丙沙星在羅非魚血漿、肌肉、肝和腎中含量占恩諾沙星的比例分別為4.68%、3.97%、6.03%、3.22%，說明恩諾沙星在羅非魚體內很少代謝。肝臟中環丙沙星含量最高，一方面是因為羅非魚給藥后恩諾沙星肝臟中的濃度最高，另一方面也說明恩諾沙星主要在肝臟中脫乙基代謝成環丙沙星，這與大部分水產動物體內恩諾沙星的代謝規律相一致[14,15]。在腦組織中未檢測到環丙沙星，說明腦組織基本不代謝恩諾沙星。環丙沙星在羅非魚的肝、腎和肌肉組織中的T1/2和MRT都較大，表明環丙沙星在羅非魚各組織的消除普遍較慢，滯留時間長。除此之外，各組織的環丙沙星在達峰時間之后都兩次或多次出現含量降低、升高再降低的現象。這可能是由于恩諾沙星代謝環丙沙星后的肝腸循環產生的，魚體中將恩諾沙星代謝成環丙沙星的主要器官是肝臟，恩諾沙星脫乙基后形成的環丙沙星由肝臟排出后進入腸道，組織對其產生了代謝后的再吸收。恩諾沙星和環丙沙星兩種藥物的雙重代謝，造成了峰值時間后環丙沙星藥物濃度的波動，在很多水產動物中，環丙沙星都呈現出這一規律[16-18]。

3.3 恩諾沙星乳的優越性

本研究所用的恩諾沙星乳新劑型，具有溶解度好、易吸收、抗菌活性強、與普通的恩諾沙星粉劑相比，其抑菌作用提升了1倍[19]。有研究表明，羅非魚單次口灌40 mg/kg魚體重恩諾沙星普通劑型，血漿中恩諾沙星在1 h的Cmax為3.47 mg/L[7]。本研究中，羅非魚單次口灌10 mg/kg魚體重恩諾沙星乳后，2 h的Cmax為4.38 mg/L，給藥濃度是上述研究的四分之一，血藥濃度峰值卻高于3.47 mg/L，說明恩諾沙星乳新劑型促進了羅非魚對藥物的吸收，提高了生物利用度。封琦等[20]的研究也指出同一藥物不同劑型在同一物種中的藥代動力學特征也會有所不同。恩諾沙星乳納米粒子粒徑為納米級，納米粒子的重要特征是具有靶向作用，能夠突破血腦屏障進入腦組織發揮作用[21]。由于血腦屏障的作用，所有大分子藥物和98%的小分子藥物都不能進入腦組織，很多神經性疾病不能被有效治療[22]。據報道，β-內酰胺類抗菌藥物中的第三、四代頭孢類菌素藥物的血腦屏障通透率僅為5%～15%[23]；羅非魚單次口灌10 mg/kg 恩諾沙星乳后，恩諾沙星在腦組織和血漿中的分布見圖1，藥物峰濃度分別為4.31 mg/kg 和4.38 mg/L，兩者濃度差異不大，證實了恩諾沙星乳具有極高的血腦屏障透過性，完全突破了血腦屏障，可用于治療魚類中樞神經系統因細菌感染的疾病。

3.4 恩諾沙星乳的給藥方案探討

恩諾沙星對大多數水產動物致病病原菌的MIC均較小，如鏈球菌屬(0.25～0.45 mg/L)[24]。根據邴曉菲等[25]以及曾蘇[26]的研究，Cmax/MIC﹥8時，臨床有效率可達90%。本實驗中血漿中的恩諾沙星的Cmax=4.38 mg/L，腦組織中的Cmax=4.31 mg/L，其他組織的藥物濃度均大于血漿和腦組織，可以滿足絕大部分的水產動物疾病的治療需要。以10 mg/kg單次給藥恩諾沙星乳后，對MIC較高的鏈球菌(0.45 mg/L)，血漿及各組織中有效藥物濃度維持時間都在24 h以上。因此，對恩諾沙星敏感的病原菌所引起的疾病，可考慮單次給藥10 mg/kg恩諾沙星乳，1日給藥一次，連續給藥3日。