彭澤鯽♀×興國紅鯉♂雜交四倍體子代倍性鑒定及染色體核型分析

張慶飛，郭青松，虞炯瑩，操文杰，王衛民

(1.華中農業大學水產學院，農業動物遺傳育種與繁育教育部重點實驗室，農業農村部淡水生物繁育重點實驗室，武漢 430070；2.武漢市江夏區農業綜合執法大隊，武漢 430200)

彭澤鯽(Carassiusauratusvar.pengsenensis)產于江西省九江市彭澤縣，屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)鯽屬(Carassius)，具有生長快、個體大、抗病性及抗逆性強、營養豐富的特點，是淡水養殖的優良品種。彭澤鯽最初被認為是正常的二倍體(2n=166)，營兩性生殖[1]，現已公認彭澤鯽為三倍體(3n=150+)魚類，且生殖方式為兩性型雌核發育[2]。興國紅鯉(Cyprinuscarpiouvar.singuonensis)產于江西省興國縣，屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)鯉屬(Cyprinus)，其背寬肉厚、肉質鮮美、生長快、食性廣且抗逆性強，同時興國紅鯉雜交親和力強，是重要的雜交親本。

天然雌核發育的魚類通常為三倍體或四倍體[3]，在發育過程中精子只刺激卵子發育，本身并不融合，后代的生物學特性幾乎與母本相同而不具有父本的遺傳性狀。目前已有研究表明，利用異精刺激天然雌核發育魚類可產生正常的子代，但是不同種類的雄性精子產生的誘導效果差異顯著。本實驗室在興國紅鯉雄魚精子刺激彭澤鯽雌核發育的子代中發現了四倍體，并于2020年5月進行擴繁得到子二代，推測該四倍體發生了兩性融合，產生了遠緣雜交四倍體。遠緣雜交魚類通常結合雙親的優勢性狀，具有較高的育種潛力，但能否穩定遺傳仍存疑問。染色體作為遺傳信息的載體，可以直觀地了解其遺傳變化和遺傳特征，進一步判斷子代的親緣關系，因而對其子代進行倍性鑒定及染色體核型分析極為重要。

本研究通過對彭澤鯽♀×興國紅鯉♂雜交四倍體子代進行倍性鑒定和染色體核型分析，旨在為遠緣雜交多倍體育種提供理論依據，探討新品種的應用前景，同時也為原位雜交等研究提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

彭澤鯽親本來源于江西省水產科學研究所，于華中農業大學南湖水產養殖基地進行產前培育，并在2020年5月挑選性腺成熟且健康無病的親本進行人工繁殖得到子代；實驗室前期在興國紅鯉精子刺激彭澤鯽卵子雌核發育的子代中發現四倍體，并于2020年5月挑選性腺成熟且健康無病的親本進行繁殖得到健康子代。

1.2 實驗方法

1.2.1 血液采集

用EDTA抗凝劑浸潤一次性注射器內壁，采用尾靜脈抽血的方式，從魚體側線下方扎針，碰到脊柱時向后輕拉針頭，抽血1 mL置于2 mL離心管中，4 ℃保存，用于測定DNA相對含量，未加抗凝劑的血液直接用于血涂片的制備。

1.2.2 DNA相對含量測定

選用三倍體彭澤鯽血細胞作為內參，通過流式細胞儀檢測倍性。取抗凝血劑10 μL置于2 mL離心管中，加入500 μL DAPI染液，再加入500 μL PBS緩沖液，用300目濾膜過濾，避光染色5 min后，上機檢測。

1.2.3 血涂片制備

取一滴未加抗凝劑血液滴在光滑平整的載玻片上，將載玻片緩慢靠近血液，待血液散開后，以30°～40°的角度勻速向前推片形成血膜，待血膜完全晾干后進行染色。將Giemsa母液用PBS緩沖液稀釋10倍后配置成工作液，滴加Giemsa染液染色1 min，再滴加等量的PBS緩沖液，染色30 min。30 min后流水沖洗，室溫干燥。每種魚制作10張血涂片，在Olympus正置顯微鏡下觀察拍照，每張血涂片測量20個紅細胞的長軸a和短軸b，根據公式表面積S=πab/4、體積V=a2b/1.91計算紅細胞和細胞核的表面積與體積。

1.2.4 組織塊原代細胞培養

取兩種子代幼魚并用75%酒精消毒體表，剪取鰭條及肌肉置于盛有AIM的培養皿中浸泡2 h，每半小時更換AIM，期間切除刮去多余組織。將組織塊切碎成1 mm2小塊均勻鋪散在25 cm2細胞培養瓶中，用移液管從細胞培養瓶側面緩慢加入4～5 mL原代培養基，置于28 ℃恒溫培養箱中倒置6～8 h，翻轉后靜置培養。當細胞長滿時，可消化傳代，原瓶可保留繼續生長細胞。

1.2.5 染色體標本制備

參考祝冬梅[4]染色體標本制備方法，取鋪滿細胞的細胞瓶，加入秋水仙素至終濃度為1.5 μg/mL，于28 ℃恒溫培養箱處理3 h。吸出秋水仙素，用0.25%胰酶消化，再加入等量原代培養基，中止消化。將細胞混合液轉入離心管，1 000 r/min離心7 min，棄上清液。冰水低滲10 min，1 000 r/min離心7 min。用卡諾固定液(甲醇 ∶冰乙酸=3 1，現配現用)固定2～3次，每次15 min，1 000 r/min離心7 min。吹打混勻細胞，滴片后自然風干，用Giemsa染液染色15 min，沖洗后自然晾干。

1.2.6 核型分析

用Olympus正置顯微鏡低倍鏡查找分裂相，再用油鏡拍照。選取126個分散良好、圖像清晰、數目完整的中期分裂相統計染色體數目。并從中選取5個分散良好、形態清晰的中期分裂相，利用Photoshop、Image J軟件放大圖像并參考Levan等[5]提出的染色體類型劃分標準對5個分裂相進行參數測量分析，染色體相對長度=(染色體長度/染色體組總長)×100；臂比=長臂/短臂，制作染色體核型圖。

2 結果

2.1 紅細胞DNA相對含量

以彭澤鯽紅細胞為內參，利用流式細胞儀對雜交四倍體子代紅細胞DNA相對含量進行測定，結果見圖1。如圖，橫坐標表示紅細胞熒光值，縱坐標表示細胞數目。彭澤鯽平均熒光值約為301.24±2.42，雜交四倍體子代熒光值約為405.79±3.18，二者DNA相對含量比為0.74，即雜交四倍體子代為四倍體。

圖1 兩種子代紅細胞DNA相對含量測量峰圖

2.2 紅細胞形態比較

彭澤鯽♀×興國紅鯉♂雜交四倍體子代、彭澤鯽雌核發育子代血涂片經Giemsa染液染色晾干后，在Olympus BX53正置顯微鏡油鏡下觀察紅細胞形態，結果見圖版1。如圖所示，兩種魚紅細胞經染色后細胞核顏色較深，核質分明。彭澤鯽雌核發育子代紅細胞長軸略短于雜交四倍體子代，從形態上看雜交四倍體子代更長。由于倍性增加紅細胞發生異形的概率增高，因而雜交四倍體子代血涂片中發現較高比例的異形紅細胞，如啞鈴型紅細胞(黑色箭頭)、無核紅細胞(綠色箭頭)、多核紅細胞(藍色箭頭)，而在彭澤鯽中異形紅細胞較少。

2.3 紅細胞大小比較

彭澤鯽雌核發育子代、彭澤鯽♀×興國紅鯉♂雜交四倍體子代紅細胞測量結果見表1。結果顯示：雜交四倍體子代紅細胞長軸為彭澤鯽的1.13倍，差異極顯著(P<0.01)，但紅細胞短軸與彭澤鯽差異不顯著，四倍體子代紅細胞表面積、體積均極顯著地大于彭澤鯽(P<0.01)，分別為彭澤鯽的1.08、1.22倍。因而在顯微鏡下可以觀察到雜交四倍體子代紅細胞更大、更長，彭澤鯽紅細胞呈小且圓的橢圓形。在紅細胞核方面，四倍體子代的長軸、核表面積、核體積極顯著地大于彭澤鯽(P<0.01)，分別為彭澤鯽的1.17、1.20、1.40倍，相同的是紅細胞核短軸二者差異不顯著。

表1 彭澤鯽雌核發育子代、彭澤鯽♀×興國紅鯉♂雜交四倍體子代紅細胞及核大小比較

2.4 肌肉、鰭條組織細胞培養

兩種子代肌肉、鰭條組織塊接種到T25培養瓶后生長情況見圖版Ⅱ、Ⅲ。如圖所示，兩種子代肌肉、鰭條組織塊貼壁情況較好，細胞圍繞組織塊呈發散狀生長。彭澤鯽組織塊3 d開始遷出細胞；7 d時在組織塊周圍有梭狀細胞迅速生長；9 d時組織塊之間細胞接觸，生長迅速；15 d時，一些組織塊周圍細胞堆積變形，生長緩慢；18 d時基本鋪滿T25細胞瓶的80%，達到傳代要求。雜交四倍體子代同樣是3 d遷出細胞；5 d時已有組織塊之間細胞接觸生長；10 d時生長迅速；18 d時已經達到傳代要求。傳代結果見圖版Ⅳ、Ⅴ，由于組織塊周圍細胞密集較難被胰酶消化下來，在傳代過程中一些細胞被胰酶過度消化導致細胞死亡(黑色箭頭)，懸浮在培養基中。相比于原代培養，傳代培養細胞增殖速度快，僅4～5 d就可以長滿T25細胞培養瓶。截至目前，兩種子代細胞已經傳代到第10代。

圖版Ⅳ 彭澤鯽子代肌肉、鰭條組織塊傳代培養(4×10)

圖版Ⅱ 彭澤鯽雌核發育子代肌肉、鰭條組織塊原代培養(4×10)

2.5 染色體數目統計

染色體數目統計結果見表2。經過觀察統計，染色體數目在160以下有5個細胞；161～170有3個細胞；171～180的有9個細胞；181～190的有23個細胞；191～200的有15個細胞；大部分完整的中期分裂相染色體數目在201～210條，占55.56%。染色體數目分布范圍廣泛，但是在這個范圍內并沒有明顯的眾數。

表2 彭澤鯽♀×興國紅鯉♂雜交四倍體子代染色體數目

2.6 染色體核型分析

按照Levan[6]的染色體劃分標準，根據測量結果對染色體進行分型，結果見圖版Ⅵ，其中包括42條中部著絲粒染色體(m)、64條亞中部著絲粒染色(sm)、62條亞端部著絲粒染色體(st)、32條端部著絲粒染色體(t)，染色體臂數(NF)為368，其核型公式為4n=42m+64sm+62st+32t，NF=368，未發現異型性染色體。

圖版Ⅵ 彭澤鯽♀×興國紅鯉♂雜交四倍體子代染色體

3 討論

3.1 DNA相對含量與倍性

魚類遠緣雜交可以獲得不同倍性的雜交后代[6]，但是僅通過魚類體表特征很難鑒定魚類的倍性。常用的倍性鑒定方法有相對DNA含量測定法、紅細胞體積測量法、染色體數目及核型分析法[7]。DNA作為主要的遺傳信息，其含量與倍性呈正比關系[8-9]，利用流式細胞儀測定其相對含量可以迅速、直接地反映魚類染色體倍性，這種方法的優勢在于對魚體的傷害小、自動化、快速高通量且準確度高。目前，通過流式細胞儀技術鑒定倍性已經被廣泛運用于動、植物中，如陳落落等[10]通過此方法鑒定出二倍體、三倍體虹鱒；方禮豹等[8]采用流式細胞計數法鑒定出二倍體、四倍體泥鰍及大鱗副泥鰍雜交四倍體子代的倍性；劉少軍[6]通過此方法鑒定鯽魴、鯽鲌等多種四倍體魚類的倍性。另外，在馬鈴薯[11]、毛竹[12]等多種植物倍性鑒定上也廣泛運用此技術。本研究中，將三倍體彭澤鯽作為內參，測定雜交四倍體子代紅細胞相對DNA含量約為內參的1.33倍，即該雜交四倍體子代為四倍體，這一結果與桂建芳等[13]利用異源精子誘導異育銀鯽雌核發育其子代可能存在四倍體的研究結果一致。本研究也表明，通過選取合適的內參，流式細胞術是一種快速、可靠鑒定倍性的方法。

3.2 紅細胞形態、大小的比較

紅細胞體積測量法也是輔助鑒定魚類倍性的常用方法，其原理是細胞中染色體數目或DNA的含量與細胞核的大小呈正比[14]，且細胞總是維持穩定的核質比[15]。這種方法的優勢在于材料易得、易行直觀。本研究中雜交四倍體子代紅細胞長徑略大于彭澤鯽，其形態相較于彭澤鯽雌核發育子代更長。同時我們在雜交四倍體子代中發現了許多啞鈴狀核、無核、多核等變異紅細胞。這些異形現象在多倍體紅細胞中是客觀存在的[16]。同時在現有的鯽、草魚、鯉、鳙等硬骨魚類血涂片研究中都發現有紅細胞分裂的現象[16]，因而推測這種異形紅細胞可能是由于紅細胞分裂導致；也可能由于倍性的增加，部分紅細胞難以維持穩定，導致細胞變形；此外有研究表明，饑餓脅迫也會影響紅細胞形態，導致產生不規則形狀或異形核紅細胞[17]。但是這種現象在彭澤鯽中極少，因而這一異形現象也可以成為判斷倍性的依據。本研究中雜交四倍體子代紅細胞體積是彭澤鯽的1.22倍，核體積是彭澤鯽的1.40倍，但與預測理論值1.33不符。這一結果與陳落落等[10]、俞小牧等[18]研究結果相似。導致測量結果與理論值偏差與紅細胞的生長受到許多因素的影響有關，如魚類年齡大小、性別、生活環境、生長代謝情況等。同時本研究在同一張血涂片中也觀察到了大小不同的紅細胞，這是因為這些細胞處在不同的生長時期。與本研究不同的是，鄒曙明等[19]在同源四倍體和三倍體團頭魴紅細胞研究中發現其體積并未隨倍性增加而增大。這表明不同魚類紅細胞大小是有差異的，單純依靠紅細胞測量法鑒定倍性可能不準確，因而結合上述流式細胞術對魚體進行倍性鑒定更為可靠。

3.3 組織細胞培養及染色體標本的制備

魚類的肌肉和鰭條組織具有極強的再生能力，遷出細胞的效果較好，又易于貼壁生長，是培養原代細胞的理想材料，同時染色體數目以及核型分析也是細胞遺傳學的基礎[5]。在本實驗中，因為兩種子代規格較小，取頭腎等方法均不適用，因而選取了肌肉、鰭條組織進行細胞培養。根據培養結果發現，這兩種組織遷出的細胞具有較強的增殖能力，通常3 d就可以達到再次傳代的要求，目前可以傳代到10代以上，但能否建立細胞系仍需進一步研究。此外，有研究表明，不同濃度的秋水仙素、低滲、固定液比例、滴片高度、冷熱滴片法等因素會影響染色體的形態。在制備染色體標本時本研究發現提前12 h更換培養基會使細胞狀態較好，染色體中期分裂相更多，形態更清晰；冰水低滲效果在15 min為宜，否則離心后細胞較少，但是隨著傳代次數的增加，細胞越來越難漲開，可能是由于細胞在多次傳代后衰老，已經過了對數生長期，細胞狀態不好；由于染色體數目較多，固定液最佳比例為甲醇 ∶冰醋酸=2 ∶1；離心速度不能超過1 000 r/min，否則細胞容易脹破；滴片高度要大于1 m。

3.4 染色體數目及核型分析

染色體是遺傳信息的載體，是生命體進化的基礎，同時染色體分析也是鑒定雜交四倍體子代倍性、遺傳組成最直接、最準確的方法[20]。近年來，許多研究者對不同地區鯽以及雜交鯽進行了倍性鑒定和染色體核型分析的研究，結果見表3。

表3 不同地區鯽、雜交鯽核型分析結果

由表可知不同地區鯽以及雜交鯽的核型公式均有不同。例如貝爾鯽與銀鯽均為三倍體但核型公式卻不同；銀鯽的染色體核型與野生鯽呈倍性關系；雜交鯽后代染色體核型公式會因父母本的不同而不同等，這些現象說明在鯽的進化過程中發生了染色體數目的加倍以及結構變異，同時這種核型的差異性也可能是因為地理種群的差異或研究方法、測量誤差所致。本實驗中，興國紅鯉是二倍體，核型公式為2n=28m+22sm+50st，NF=150；彭澤鯽是公認的三倍體，染色體數目為3n=150+，其核型公式為3n=33m+51sm+33st+33t[2]。本實驗通過對126個染色體中期分裂相計數、測量分析得知：雜交四倍體子代的染色體數目分布范圍較廣，在150～210均有分布，其中200～210條占55.56%，但沒有明顯的眾數。因而我們推測雜交四倍體子代的染色體繼承了彭澤鯽的150+染色體以及本興國紅鯉配子的染色體，其核型公式為4n=42m+64sm+62st+32t，NF=368。造成分布范圍廣的原因可能是在制備染色體標本時細胞疊加導致染色體增加或者滴片時染色體丟失[28]。在鯽的染色體研究中并不缺乏染色體數目不確定的情況，如銀鯽。有研究表明二倍體銀鯽染色體數目為100；三倍體為150或由150條基本染色體和6條或8～12條超數染色體組成；四倍體則為206條[29-30]，這些結果與本實驗結果一致。但是我們發現雜交四倍體子代核型公式與彭澤鯽加興國紅鯉配子核型公式并不相同，這可能由以下原因導致：在細胞生長發育的過程中，染色體呈現周期性變化，盡管有絲分裂中期是最好的觀察時期，但仍受外界環境影響，例如制備染色體過程中秋水仙素的濃度、培養溫度等因素會導致染色體縮短，細胞狀態、低滲液種類及處理時間、固定液比例、滴片高度、冷熱滴片法等因素會影響染色體的形態；精卵結合后，染色體發生重組；實驗方法的不同以及測量過程中的誤差等[23]。

小島吉雄[31]將真骨魚類劃分為低位類、中位類和高位類3個演化類群。從低位類群到高位類群，染色體越收斂，端部著絲粒染色體越多，染色體臂數越少。根據吳政安[32]研究結果：中部、亞中部著絲粒染色體較多屬于低位類；反之，為高位類型。在本實驗結果中，中部、亞中部染色體共101條，占50.5%，即彭澤鯽♀×興國紅鯉♂雜交四倍體子代屬于中位類群。

4 小結

綜上所述，采用三種方法對彭澤鯽♀×興國紅鯉♂雜交四倍體子代倍性鑒定結果為四倍體，其染色體核型公式為4n=42m+64sm+62st+32t，NF=368。理論上該雜交四倍體子代遺傳了彭澤鯽和興國紅鯉的染色體，但仍需要對其染色體組成進一步分析。由于遠緣雜交四倍體子代可能會體現出雜種優勢，有關雜交四倍體子代在生長、形態、抗病等優勢有待進一步研究。

圖版Ⅲ 彭澤鯽♀×興國紅鯉♂雜交四倍體子代肌肉、鰭條組織塊原代培養(4×10)

Plate Ⅲ Primary culture of muscle and fin tissue blocks ofC.auratusvar.pengsenensis×C.carpiovar.singuonensis(4×10)

1.2 d肌肉組織塊貼壁；2.2 d鰭條組織快貼壁；3.3 d開始遷出細胞；4.5 d細胞生長迅速；5.10 d時組織塊遷出細胞接觸，生長迅速；6.15 d組織塊周圍細胞密集，變形；7.18 d細胞鋪滿培養瓶80%

圖版Ⅴ 彭澤鯽♀×興國紅鯉♂雜交四倍體子代肌肉、鰭條組織塊傳代培養(4×10)

Plate ⅤC.auratusvar.pengsenensis×C.carpiovar.singuonensissubculture of muscle and fin tissue of hybrid progeny (4×10)

1.代傳1 d；2.傳代2 d；3.傳代4 d；4.傳代5 d；黑色箭頭為死亡細胞

圖版Ⅰ 彭澤鯽雌核發育子代、彭澤鯽♀×興國紅鯉♂雜交四倍體子代紅細胞(100×10)

Plate I red blood cells (100 × 10) of inbred progenies ofC.auratusvar.pengsenensisand hybrid progeny ofC.auratusvar.pengsenensis×C.carpiovar.singuonensis

圖1～2.彭澤鯽雌核發育子代紅細胞圖；3～4.彭澤鯽♀×興國紅鯉♂雜交四倍體子代紅細胞圖；藍色箭頭為多核紅細胞；綠色箭頭為無核紅細胞；黑色箭頭為啞鈴型紅細胞