不同手術時機肋骨環(huán)抱器手術對肋骨骨折大鼠預后影響的實驗研究

馬兵兵，王鵬國

(1.兵器工業(yè)五二一醫(yī)院心胸外科，陜西 西安 710065；2.陜西省核工業(yè)二一五醫(yī)院，陜西 咸陽 712000)

骨折是指骨的力學完整性遭到連續(xù)性中斷或破壞，同時伴有局部軟組織及血管的損傷。肋骨骨折為骨折的主要類型，也是比較嚴重的胸部損傷[1-2]。當前隨著交通事故與工業(yè)受傷的發(fā)生頻率日益增高，肋骨骨折的發(fā)生率也隨之逐漸增加，已成為臨床上常見的創(chuàng)傷性疾病之一[3]。手術為肋骨骨折的主要治療方法，特別是當前微創(chuàng)手術具有創(chuàng)傷小、恢復胸廓的完整性和穩(wěn)定性、復位穩(wěn)定可靠、消除骨折斷端的異常刺激等特點，但是也存在骨折愈合時間比較長等不足，為此在臨床上多需要進行輔助治療[4]。其中肋骨環(huán)抱器是一種可彎曲塑形的并環(huán)抱固定肋骨的內固定物，有利于快速固定肋骨骨折斷端，在合適的溫度下環(huán)抱器迅速恢復形狀，從而牢固固定肋骨骨折[5-6]。同時現(xiàn)代研究表明骨折的愈合是骨組織多種生理因子共同參與的修復過程，也是由神經、體液共同調節(jié)的復雜過程，涉及到肉芽組織修復期、軟骨痂形成期、硬骨痂形成期、骨痂重塑期等，然后讓骨恢復原有結構形態(tài)[7]。由于骨折手術治療過程中對骨組織生物學環(huán)境的改變，以及不同手術時機所導致的骨組織力學環(huán)境的變化可對骨折愈合產生一定的影響[8-9]。本研究具體探討了不同手術時機肋骨環(huán)抱器手術對肋骨骨折大鼠的預后，希望明確肋骨環(huán)抱器的應用時機，為促進肋骨骨折愈合提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 清潔級健康10周齡雄性SD大鼠購自南京君科生物工程有限公司[體重(200±20)g，飼養(yǎng)于本院實驗動物中心提供]，飼養(yǎng)條件：空氣相對濕度30%～40%，室溫(22±2)℃，自由攝食水，12 h間隔照明，每周2～3 次更換墊料。動物許可證號SYXK832913，本實驗符合本院動物保護委員會的要求。鈦鎳記憶合金環(huán)抱器購自泰州市宇杰醫(yī)療器械有限公司，純鈦爪形肋骨接骨板購自安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.2 肋骨骨折模型的制備 所有大鼠適應性喂養(yǎng)1周，10%的水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠。大鼠取俯臥位，在大鼠左耳下緣約2.5 cm左右，距脊柱中線約1.5 cm處作為切口部位，依次切開皮膚、皮下組織和深筋膜，暴露并固定肋骨，用眼科剪剪斷成橫行骨折，然后逐層縫合關閉創(chuàng)口。

將建模成功的肋骨骨折大鼠(n=54)隨機平分為模型組、早期組與晚期組，根據肋骨橫徑、形狀及長度選擇合適的鎳鈦合金環(huán)抱器與純鈦爪形肋骨接骨板。早期組與晚期組分別在建模后1 d與3 d后將環(huán)抱器置于肋骨斷端，固定環(huán)抱器兩端，用45 ℃左右溫鹽水紗布握住放好的環(huán)抱器，環(huán)抱器可自動復原可固定在骨折處，消除反常呼吸、支撐塌陷的胸廓。模型組不進行環(huán)抱器手術處理。

所有大鼠在建模與手術過程中分籠放置，注意大鼠保暖。

1.3 觀察指標 ①在術后第1周、第2周每組分別處死9只大鼠，以肋骨骨折區(qū)域為中心剪斷肋骨及其相鄰兩根肋骨，拍攝X線片，測定與記錄骨小梁寬度、骨小梁成骨指數(shù)。②對大鼠進行眼窩采血，分為三管。第一管不抗凝，靜置30 min后3000 r/min 離心10 min，分離上層血清，采用酶聯(lián)免疫法檢測血清核因子kappaB受體活化因子配體(Receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)與血清中骨保護素(Osteoprotegerin,OPG)含量。第二管進行抗凝，靜置30 min后3000 r/min離心10 min，分離上層血漿，采用全自動生化分析儀檢測血漿血管內皮生長因子(VEGF)與骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2)含量。第三管進行抗凝，靜置30 min后3000 r/min 離心10 min，分離下層全血細胞，采用流失細胞儀檢測CD4+與CD8+T淋巴細胞含量。③去除骨折肋骨周圍兩根肋骨，剔除表面附著肌肉等軟組織，在4%多聚甲醛溶液中固定，制成病理切片，觀察骨折愈合情況。

2 結 果

2.1 病理情況比較 所有大鼠在手術過程中都生命體征穩(wěn)定。模型組大量骨祖細胞及成纖維細胞分布在骨折區(qū)域，未見新生的骨小梁，大量炎細胞浸潤。早期組骨小梁融合成片，骨基質形成，大量骨細胞沉積于骨基質中。晚期組出現(xiàn)軟骨細胞及新生骨小梁，可見大量的成骨細胞與造血細胞灶。

2.2 三組術后不同時間點骨組織形態(tài)指標比較 見表1。早期組與晚期組的術后第1周、第2周骨小梁寬度、骨小梁成骨指數(shù)都高于模型組(均P<0.05)，早期組高于晚期組(P<0.05)。

表1 三組術后不同時間點骨組織形態(tài)指標比較

2.3 三組術后不同時間點血清RANKL與OPG含量比較 見表2。早期組與晚期組的術后第1周、第2周的血清RANKL含量低于模型組(均P<0.05)，血清OPG含量高于模型組(均P<0.05)，早期組與晚期組對比差異也都有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 三組術后不同時間點血清RANKL與OPG含量比較(pg/ml)

2.4 三組術后不同時間點血漿VEGF與BMP-2含量比較 見表3。早期組與晚期組的術后第1周、第2周的血漿VEGF與BMP-2含量高于模型組(均P<0.05)，早期組高于晚期組(P<0.05)。

表3 三組術后不同時間點血漿VEGF與BMP-2含量比較(pg/ml)

2.5 三組術后不同時間點CD4+、CD8+T淋巴細胞比例比較 見表4。早期組與晚期組的術后第1周、第2周的CD4+T淋巴細胞比例高于模型組(均P<0.05)，早期組高于對照組(P<0.05)，三組不同時間點的CD8+T淋巴細胞比例對比差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

表4 三組術后不同時間點CD4+、CD8+T淋巴細胞比例比較(%)

3 討 論

肋骨骨折的發(fā)生，其在一定程度上可使局部胸壁失去完整肋骨支撐而軟化，導致出現(xiàn)連枷胸，也可出現(xiàn)反常呼吸運動，誘發(fā)機體出現(xiàn)血胸、氣胸等并發(fā)癥，嚴重情況下可導致機體死亡。肋骨骨折的常見臨床癥狀為局部疼痛，特別在咳嗽時疼痛更明顯[10]。隨著醫(yī)學技術的發(fā)展與手術內固定器械的更新，手術治療肋骨骨折及糾正連枷胸取得了很好的效果。本研究顯示早期組與晚期組的術后第1周、第2周骨小梁寬度、骨小梁成骨指數(shù)都高于模型組(均P<0.05)，早期組高于晚期組(P<0.05)，表明肋骨環(huán)抱器早期手術在肋骨骨折大鼠的應用能促進骨折愈合。從機制上分析，鈦鎳合金是一種形狀記憶合金，其可利用鎳元素在溫度變化下的記憶特性，具有很好的可塑性，塑形完成后迅速固定至肋骨骨折斷端，從而牢固固定肋骨斷端[11]。而早期手術的應用能盡早使得大鼠的胸廓畸形盡快恢復正常形狀，促使大鼠盡快恢復呼吸功能，促使骨折斷端骨膜內出現(xiàn)成骨反應，血管進入軟骨骨痂，破骨細胞吸收鈣化軟骨[12-13]。

骨折的發(fā)生是一系列細胞和細胞因子相互作用，伴有大量的RANKL釋放，也會抑制OPG的釋放。骨折愈合的初期炎癥期，由于骨折局部為低pH值和高乳酸濃度環(huán)境，是影響骨折愈合的重要因素。特別是骨折術后早期血腫形成，標志著炎性反應的開始[14]。RANKL由活化的T細胞、成骨細胞分泌，與RANK結合后可激活下游通路的表達，從而促進破骨前體細胞分化為破骨細胞[15]。OPG 屬于腫瘤壞死因子受體家族成員，可競爭性的抑制RANKL與RANK結合，從而抑制骨吸收的發(fā)生。VEGF可與血管內皮細胞上的VEGF受體發(fā)生特異性結合，可以通過增加細胞外基質而進一步促進血管形成[16]。并且其也可通過與骨折斷端的成骨細胞及周圍軟組織細胞上受體結合，改善骨折局部血運及缺氧狀態(tài)，加速骨折斷端局部壞死組織的移除，為骨折愈合提供營養(yǎng)物質及骨修復細胞[17]。BMP-2能誘導間充質細胞轉化為軟骨細胞，也可促進骨床再生，增加軟骨和骨的合成，從而促進骨折愈合[18]。本研究顯示早期組與晚期組的術后第1周、第2周的血清RANKL含量低于模型組(均P<0.05)，血清OPG含量高于模型組(均P<0.05)，早期組與晚期組對比差異也都有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；早期組與晚期組的術后第1周、第2周的血漿VEGF與BMP-2含量高于模型組(均P<0.05)，早期組高于晚期組(P<0.05)。從機制上分析，環(huán)抱器具有生物相容性好、低導磁、應力遮擋率低等特點，其所產生的握持力可維持骨折斷端穩(wěn)定。在骨折術后早期進行應用能通過分泌細胞因子能夠促進成纖維細胞的分化和血管形成，從而調節(jié)VEGF、BMP-2、RANKL、OPG的表達，促使成骨細胞形成新骨[19]。

人體的脊柱、胸骨、肋骨、肋軟骨構成了骨性胸廓的框架，在正常的呼吸循環(huán)中提供著胸廓運動的靈活性。肋骨骨折可導致機體血胸和氣胸等，如不采取積極的治療措施，會引發(fā)失血性休克甚或死亡等[20]。T淋巴細胞在骨折愈合的炎癥階段與修復塑形階段都發(fā)揮重要作用，其中CD4+T細胞、CD8+T細胞都可直接或間接作用于骨髓干細胞以及成骨細胞，調節(jié)骨穩(wěn)態(tài)，從而影響著骨折愈合的過程[21-23]。本研究顯示早期組與晚期組的術后第1周、第2周的CD4+T淋巴細胞比例高于模型組(P<0.05)，早期組高于對照組(P<0.05)，三組不同時間點的CD8+T淋巴細胞比例對比差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，表明早期進行環(huán)抱器手術治療能改善機體免疫反應，并使其處于平衡穩(wěn)定狀態(tài)，從而促進骨折預后。本研究也存在一定的不足，沒有設置非手術治療組，觀察的時間點也比較少，將在后續(xù)研究中進行探討。

總之，早期環(huán)抱器手術在肋骨骨折大鼠的應用能改善機體免疫反應，促進VEGF、BMP-2、OPG的釋放，抑制RANKL的表達，從而促進骨折愈合。