UPLC-TOF-MS與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合探討人參改善胰島素抵抗的作用機(jī)制＊

殷怡帆，羅朵生＊＊，郭 姣

（1.廣東藥科大學(xué)廣東省代謝病中西醫(yī)結(jié)合研究中心 廣州 510006；2.廣東藥科大學(xué)廣東省代謝性疾病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣州 510006）

胰島素抵抗（Insulin resistance，IR）是指胰島素促進(jìn)葡萄糖攝取的作用降低而胰島素的補(bǔ)償性分泌增加的狀態(tài)，與非酒精性脂肪性肝病、2型糖尿病、代謝綜合征等代謝性疾病密切相關(guān)[1]。人參是五加科植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根及根莖，中藥人參制劑對胰島素抵抗干預(yù)效應(yīng)的Meta分析發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用中藥人參制劑能顯著改善胰島素抵抗和血糖水平[2]，但其具體機(jī)制尚不明確。因此，進(jìn)一步闡明人參改善胰島素抵抗作用的藥效成分及作用機(jī)制對擴(kuò)大人參應(yīng)用范圍、開發(fā)防治胰島素抵抗藥物具有重要意義。但人參成分復(fù)雜，作用靶點(diǎn)較多，如何闡明其多成分、多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)的作用特點(diǎn)是目前面臨的瓶頸問題之一。

利用計(jì)算機(jī)科學(xué)、分子生物學(xué)、藥學(xué)等學(xué)科的成果，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以全面闡明中藥多成分、多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)的功能特點(diǎn)。本研究采用UPLC-TOF-MS分析人參化學(xué)成分，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，解析人參改善IR的潛在活性成分、作用靶點(diǎn)及機(jī)制，以期為非酒精性脂肪性肝病、2型糖尿病、代謝綜合征等代謝性疾病臨床干預(yù)治療提供新的思路。

1 儀器與材料

超高效液相色譜分析系統(tǒng)（Agilent公司，美國），高分辨四級桿與飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀（Agilent公司，美國）、C18色譜柱（ACQUITY UPLC CSH，2.1 mm×100 mm，1.7μm），超聲波清洗器（DL-360A，50 Hz，400 W，上海之信儀器有限公司），低溫高速離心機(jī)（FRESCO17，Thermo公司，美國），甲醇，乙腈（Merck公司，德國），超純水（屈臣氏），人參（購自長白工坊科貿(mào)有限公司）[3]。

2 方法

2.1 化學(xué)成分分析

稱取人參藥材粉末0.3 g，加入50 mL 60%甲醇溶液，超聲提取1 h，離心5 min（轉(zhuǎn)速12000 rpm，溫度20℃），取上清液待測。進(jìn)樣量：5μL；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：40℃；二元梯度洗脫，流動相A為水，B為乙腈；梯度洗脫條件如下（表1）。質(zhì)譜條件參考文獻(xiàn)報道[4]，質(zhì)譜條件：電噴霧離子源正離子模式（ESI+）：毛細(xì)管電壓（capillary):2800 V，錐孔電壓（samplecone)：20 V，離子源 溫（source temperature)：100℃，脫 溶 劑 溫 度（desolvation temperature)：350℃，脫溶劑N2體積流量為500 L/h，錐孔反吹N2體積流量為50 L/h，脫溶劑氣為N2，碰撞氣體為Ar。

表1 超高效液相梯度洗脫分析人參的條件

根據(jù)質(zhì)譜所得，結(jié)合文獻(xiàn)報道，通過分析化合物的準(zhǔn)確分子量，篩選出人參的主要化學(xué)成分。

2.2 活性成分靶點(diǎn)預(yù)測

具體預(yù)測流程參考本團(tuán)隊(duì)的報道[3]，概述如下：將上述獲得成分上傳至PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）中查詢SMILES號。將獲得的SMILES號上傳至Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch），點(diǎn)擊預(yù)測成分作用靶點(diǎn)即可進(jìn)行分析，輸出化合物靶點(diǎn)信息。把靶點(diǎn)導(dǎo)入Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/uploadlists）中，進(jìn)行批量標(biāo)準(zhǔn)化審核（物種選擇 “Homo Sapiens” ）。將審核得到的人參主要活性成分的靶點(diǎn)與CTD數(shù)據(jù)庫（http://ctdbase.org）、GeneCards（https://www.genecards.org）中胰島素抵抗有關(guān)的作用靶點(diǎn)進(jìn)行對比，篩選潛在靶點(diǎn)。

2.3 疾病靶點(diǎn)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org），選擇多種蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，物種選擇為 “Homo Sapiens” ，得到蛋白相互作用關(guān)系；將相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Cytoscape軟件中，根據(jù)分值和節(jié)點(diǎn)度值設(shè)置節(jié)點(diǎn)和邊緣的大小、顏色和粗細(xì)，得到目標(biāo)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

2.4 生物學(xué)功能和通路分析

將篩選出的人參改善胰島素抵抗作用潛在靶點(diǎn)輸入DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物學(xué)過程和通路分析。將來源于數(shù)據(jù)庫DAVID的富集分析結(jié)果導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫imageGP，然后使用插件 “MCODE” 對分析結(jié)果的生物過程進(jìn)行聚類分析。

2.5 人參活性成分靶點(diǎn)通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將上述獲得人參活性成分、疾病靶點(diǎn)、作用通路數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件中構(gòu)建人參活性成分靶點(diǎn)通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

2.6 分子對接驗(yàn)證

具體對接驗(yàn)證流程參考本團(tuán)隊(duì)的報道[3]，概述如下：選擇人參活性成分靶點(diǎn)通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點(diǎn)度值排行前4的疾病靶點(diǎn)，從RSCB PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）下載3D結(jié)構(gòu)，并用AutoDock軟件移除水分子和配體后保存為PDBQT文件。從PubChem數(shù)據(jù)庫下載人參成分2D結(jié)構(gòu)，利用PyRx軟件最小化其能量后也保存為PDBQT文件，運(yùn)用Vina對接，配體與受體可自發(fā)結(jié)合時其結(jié)合能小于0。

3 結(jié)果

3.1 人參化學(xué)成分

超高效液相色譜四極桿飛行時間混合質(zhì)譜（Ultra performance liquid chromatography quadrupole-time-offlight hybrid mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）是一種高分辨率的選擇性靈敏技術(shù)，適用于復(fù)雜藥物活性成分分析。本文采用UPLC-Q-TOP-MS分析人參的化學(xué)成分，結(jié)果顯示主要有52個色譜峰（圖1），通過化合物m/z信息，并結(jié)合文獻(xiàn)對比，得到41個已知化合物（表2）。

表2 人參化學(xué)成分表

圖1 人參化學(xué)成分分析總離子流圖

3.2 人參活性成分靶點(diǎn)信息

將潛在活性成分的SMILES信息上傳到Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫，得到4350個靶點(diǎn)，經(jīng)過篩選去重后得到667個靶點(diǎn)。將靶點(diǎn)導(dǎo)入Uniprot數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行批量標(biāo)準(zhǔn)化，下載審核過的614個靶點(diǎn)。在疾病數(shù)據(jù)庫搜索與IR相關(guān)的靶點(diǎn)，對比得到26個改善IR的潛在作用靶點(diǎn)，主要包括AKT1、AKT2、ALB、BCL2、CASP3等（表3）。

表3 化學(xué)成分潛在靶點(diǎn)

3.3 疾病靶點(diǎn)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過String數(shù)據(jù)庫得到疾病靶點(diǎn)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）。該網(wǎng)絡(luò)圖中包含有26個靶點(diǎn)、198條邊，度值越大，節(jié)點(diǎn)顏色大小越顯著，而綜合得分?jǐn)?shù)值越大，邊顏色越深、越粗。圖中節(jié)點(diǎn)度值較大的蛋白質(zhì)為AKT1、MAPK3、MAPK1、PPARG、VEGFA，表明人參改善IR可能通過多個靶點(diǎn)聯(lián)合共同發(fā)揮作用。

圖2 疾病靶點(diǎn)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

3.4 生物學(xué)功能注釋

人參改善IR潛在靶點(diǎn)GO生物學(xué)功能分析表明，GO分析有3個分支，為生物過程、細(xì)胞組分和分子功能。在氣泡圖右側(cè)用圓形、三角形和正方形分別表示生物過程、細(xì)胞組分和分子功能。Qvalue值表示富集的顯著性，顏色由綠到紅顯示，富集程度越高，顏色越紅，Qvalue值越大。氣泡的大小則顯示富集到此生物學(xué)功能的基因數(shù)量，富集的基因數(shù)量越多，氣泡越大。結(jié)果顯示（圖3），人參在改善胰島素抵抗的生物過程中主要富集到積極調(diào)控細(xì)胞遷移，對內(nèi)源性刺激的反應(yīng)，對激素刺激的反應(yīng)，對有機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)，高分子代謝過程的正調(diào)控等；細(xì)胞組分富集到細(xì)胞外空間、胞質(zhì)溶膠、微粒體、囊泡分?jǐn)?shù)等；分子功能中富集到胰島素受體底物結(jié)合、類固醇激素受體活性胰島素樣生長因子結(jié)合、配體依賴性核受體活性等生物學(xué)過程。

圖3 GO富集圖

生物分子主要通過相互作用模塊組成的分子網(wǎng)絡(luò)工作[22]，因此有必要對GO生物過程進(jìn)行模塊分析，根據(jù)MCODE聚類分析算法篩選出9個K-Core≥2的聚類模塊（圖4），其中生物過程越重要，連接節(jié)點(diǎn)的邊就越多，節(jié)點(diǎn)越大。依次是脂質(zhì)代謝過程、離子穩(wěn)態(tài)、生物種間相互作用、免疫系統(tǒng)過程、多細(xì)胞生物繁殖、核膜組織、分子功能的正調(diào)控/轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)節(jié)、細(xì)胞內(nèi)蛋白運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)、脂肪酸代謝過程等生物過程。

圖4 潛在靶點(diǎn)GO生物過程模塊分析子簇圖

3.5 靶點(diǎn)通路注釋分析

有20條通路被富集，主要涉及內(nèi)分泌系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)：胰島素信號通路（Insulin signaling pathway）、Toll樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）、T細(xì)胞受體信號通路（Tcell receptor signalingpathway）、B細(xì)胞受體信號通路（Bcell receptor signalingpathway）、FcεRI信號通路（Fc epsilon RIsignaling pathway）；物質(zhì)代謝：mTOR信號通路（mTOR signaling pathway）；神經(jīng)系統(tǒng)：神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號通路（Neurotrophin signaling pathway）；II型糖尿病、癌癥等（圖5）。表明人參改善胰島素抵抗的靶點(diǎn)分布在多條通路中，從而協(xié)調(diào)發(fā)揮作用。

圖5 靶點(diǎn)通路富集分析

3.6 人參活性成分靶點(diǎn)通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

構(gòu)建的成分靶點(diǎn)通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖中有87個節(jié)點(diǎn)，包括41種成分、26個靶點(diǎn)、20條通路和361條邊（圖6）。節(jié)點(diǎn)度值越大，說明與其相連的節(jié)點(diǎn)數(shù)越多，產(chǎn)生作用越大。其中人參二醇、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rk1、人參皂苷Rh7和人參二酮等節(jié)點(diǎn)度值較大，表明其作用靶點(diǎn)多。圖中MAPK1、VEGFA、PIK3R1、NR3C1、JUN等靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)較大，可能成為藥物作用的靶點(diǎn)。癌癥、FcεRI信號通路、II型糖尿病等通路的節(jié)點(diǎn)較大，表明人參改善胰島素抵抗與上述相關(guān)通路有關(guān)。

圖6 人參活性成分靶點(diǎn)通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

3.7 分子對接

選擇圖6中度值排名前4的靶點(diǎn)MAPK1（PDBID：6SLG）、VEGFA（PDB ID：5DN2）、PIK3R1（PDB ID：5GJI）、NR3C1（PDBID：5E69）與度值較大的19種成分進(jìn)行對接（表4）。分子對接的結(jié)合能越小，說明活性成分與靶點(diǎn)的結(jié)合活性越高。結(jié)果顯示，與MAPK1結(jié)合能最低的化合物為25-羥基原人參二醇（結(jié)合能為-7.9 kJ·mol-1），與VEGFA結(jié)合能最低的化合物為人參皂苷Rd（結(jié)合能為-9.5 kJ·mol-1），與PIK3R1結(jié)合能最低的化合物為人參皂苷Rg1（結(jié)合能為-7.7 kJ·mol-1），與NR3C1結(jié)合能最低的化合物為人參二酮（結(jié)合能為-8.1 kJ·mol-1）。以結(jié)合能≤-5.0 kJ·mol-1為篩選標(biāo)準(zhǔn)，人參中主要化學(xué)成分與主要靶點(diǎn)MAPK1、VEGFA、PIK3R1、NR3C1的結(jié)合能均小于-5.0 kJ·mol-1。由此可見，人參的主要化學(xué)成分與胰島素抵抗疾病蛋白形成構(gòu)象能量低，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，結(jié)合活性較高。

表4 分子對接結(jié)果

4 討論

以 “人參” 為關(guān)鍵詞，通過CNKI檢索2009年-2019年發(fā)表的文獻(xiàn)共計(jì)有5627篇，可見人參是研究熱點(diǎn)。以往對人參藥效學(xué)及作用機(jī)制的研究多集中在免疫調(diào)節(jié)、心腦血管病等領(lǐng)域，如抗疲勞、心肌缺血、動脈粥樣硬化等，對人參改善胰島素抵抗的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究尚未見報道。胰島素抵抗是非酒精性脂肪性肝病、2型糖尿病、代謝綜合征等代謝性疾病發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而人參可顯著改善胰島素抵抗和血糖水平，但其具體機(jī)制尚不明確，使人參應(yīng)用于代謝性疾病治療的作用未得到充分發(fā)揮。因此，為推動人參治療代謝性疾病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制研究，本研究對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行探討。

4.1 人參改善IR活性成分

結(jié)合圖6，本研究中發(fā)現(xiàn)人參二醇、人參二酮、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rk1、人參皂苷Rc、人參皂苷RD、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1等主要成分參與改善胰島素抵抗。人參皂苷主要分為人參二醇皂苷和人參三醇皂苷，兩者構(gòu)型不同，但可協(xié)同發(fā)揮作用[23]。

人參二醇型皂苷主要包括人參皂苷Rb1、Rk1、Rg3、Rg5等。研究發(fā)現(xiàn)人參二醇型皂苷可顯著降低2型糖尿病大鼠游離脂肪酸水平，改變細(xì)胞膜流動性促進(jìn)胰島素結(jié)合，降低肝糖原分解，從而改善胰島素抵抗[24]。將50μmol·L-1人參皂苷Rk1和Rg5混合物作用于3T3-L1胰島素抵抗細(xì)胞模型，能有效增加該細(xì)胞對葡萄糖的攝取，改善胰島素抵抗[25]。人參皂苷Rg3糖苷能升高db/db糖尿病大鼠血液中胰島素含量，降低血糖[26]。人參皂苷Rb1能上調(diào)PPARG的表達(dá)，增加葡萄糖向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)從而改善胰島素抵抗[27]。

人參三醇型皂苷主要包括人參皂苷Re、Rg1等。人參皂苷Re通過減輕胰島素刺激引起的GLUT4易位損傷，迅速改善高脂飲食大鼠肌肉的胰島素抵抗[28]。人參皂苷Rg1能降低糖尿病大鼠肝組織TLR4蛋白陽性細(xì)胞百分比，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低血糖水平[29]。

因此，本研究將UPLC-TOF-MS與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合，能夠間接預(yù)測人參改善胰島素抵抗的活性成分，為其有效成分篩選提供參考。

4.2 人參改善IR潛在作用靶點(diǎn)

分析靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖可見，c-Jun氨基末端激酶（JNK）、蛋白激酶B 1（AKT1）、磷脂酰肌醇-3激酶受體1（PIK3R1）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、過氧化物酶體增殖因子活化受體γ（PPARG）等靶點(diǎn)是胰島素抵抗互作網(wǎng)絡(luò)中主要靶點(diǎn)。JNK的缺失對肥胖引起的胰島素抵抗產(chǎn)生保護(hù)作用，炎癥因子TNF-α和FFAs4濃度升高激活JNK，進(jìn)而磷酸化Ser 307處的IRS-1，這是肥胖引起的胰島素抵抗的關(guān)鍵因素[30]。激活PI3K-Akt信號通路，活化的AKT調(diào)節(jié)Fox O1和GSK3等一系列下游分子，增加糖原的生成，調(diào)控脂肪酸合成基因及糖異生基因的表達(dá)。同時也有研究發(fā)現(xiàn)增加GLUT4蛋白表達(dá)，有效降低AKT1對胰島素信號傳導(dǎo)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，從而增加葡萄糖的利用率，提高細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力，改善胰島素抵抗[31,32]。VEGFA的轉(zhuǎn)錄因子miRNA-93過表達(dá)，與GLUT4 3'UTR末端位點(diǎn)結(jié)合，抑制GLUT4蛋白的轉(zhuǎn)錄翻譯和表達(dá)，降低胰島素敏感性[33]。PPARG是脂肪細(xì)胞基因表達(dá)和胰島素細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要調(diào)節(jié)者，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與脂肪細(xì)胞分化和糖脂代謝的調(diào)節(jié)[34]。因此，JNK、AKT1、PIK3R1、VEGFA、PPARG與改善胰島素抵抗機(jī)制密切相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、原人參三醇和人參皂苷Re等成分可與VEGFA、PIK3R1、JUN、PPARG等靶點(diǎn)互相作用，提示這些成分為人參改善胰島素抵抗的關(guān)鍵活性成分。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測出人參改善胰島素抵抗的潛在作用靶點(diǎn)，為后期進(jìn)一步研究人參改善IR的作用機(jī)制提供啟示。

4.3 人參改善IR分子機(jī)制

本研究發(fā)現(xiàn)人參改善IR作用與mTOR信號傳導(dǎo)通路、Toll樣受體信號傳導(dǎo)通路和胰島素受體通路等關(guān)系密切。

4.3.1 mTOR信號傳導(dǎo)通路

mTOR信號通路是PI3K/AKT的重要下游通路，在IR中發(fā)揮重要作用。胰島素與靶細(xì)胞的胰島素受體結(jié)合后磷酸化其受體底物的酪氨酸殘基，使PI3K/Akt信號通路激活，增加肝臟、肌肉、脂肪等組織對葡萄糖的攝取。當(dāng)機(jī)體糖代謝紊亂時，循環(huán)中的高糖毒性會過度激活靶細(xì)胞內(nèi)PI3K/Akt/mTOR信號通路，引起泛素-蛋白酶系統(tǒng)降解IRS1和IRS2，加重胰島素抵抗[35]。

4.3.2 Toll 4受體信號

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）是一種單跨膜非催化蛋白，能識別突破皮膚、粘膜等身體物理屏障的微生物，并激活身體產(chǎn)生免疫細(xì)胞反應(yīng)。在非特異性免疫和特異性免疫中均發(fā)揮重要作用。最新研究表明，TLR4信號通路激活后，可通過MyD88信號通路激活NF-κB通路，啟動多種炎癥因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯，介導(dǎo)機(jī)體的炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致組織器官損傷[36]。

4.3.3 胰島素通路

已有文獻(xiàn)報道PIK3R1和PPARG與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、胰島素敏感性等密切相關(guān)。路鑫鑫等[37]研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷通過增加PI3K的表達(dá)，從而上調(diào)PI3K信號通路來逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗，而PI3K-AKT通路為胰島素受體通路的主要下游信號通路。PPARG主要對脂類進(jìn)行分解代謝，除此以外還與多種疾病如糖尿病、動脈硬化和癌癥等相關(guān)，人參皂苷Rb1直接激活PPARG，對胰島素信號傳導(dǎo)途徑具有直接作用[27]。

綜上，本文首先采用UPLC-TOF-MS分析人參主要化學(xué)成分，然后運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法解析其改善IR作用的可能靶點(diǎn)及機(jī)制，并通過分子對接技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)人參的主要活性成分人參皂苷Rg1、人參皂苷Rd、人參二酮和25-羥基原人參二醇等活性成分作用于MAPK1、VEGFA、PIK3R1、NR3C1等多個靶點(diǎn)，參與脂質(zhì)代謝、離子穩(wěn)態(tài)、免疫系統(tǒng)等生物過程，調(diào)節(jié)mTOR信號傳導(dǎo)通路、Toll樣受體信號傳導(dǎo)通路和胰島素受體通路從而發(fā)揮改善胰島素抵抗作用，為進(jìn)一步開展系統(tǒng)的人參改善胰島素抵抗作用機(jī)制研究和臨床開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。同時，也為下一創(chuàng)新性研究提供線索和啟示。

本研究也存在一些不足。受限于數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)的全面性，獲得的靶點(diǎn)可能不夠精確，如能對預(yù)測的活性成分和靶點(diǎn)進(jìn)一步驗(yàn)證將更有說服力。