延衰組合物對酵母細(xì)胞壽命及氧化應(yīng)激的研究

王敏，廖林鋒，孫曉宇，任嬌艷，2*

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641；2.中新國際聯(lián)合研究院，廣東 廣州 510000）

衰老是生物隨著時(shí)間的推移， 自發(fā)的必然過程，也是應(yīng)激、勞損、營養(yǎng)失調(diào)和功能障礙等導(dǎo)致的結(jié)果[1]。 目前，關(guān)于抗衰老及相應(yīng)抗衰老劑方面的研究對人類生命、社會、經(jīng)濟(jì)具有重要價(jià)值，仍需積極探索。衰老機(jī)制的研究是生命科學(xué)領(lǐng)域的前沿課題，由于機(jī)體衰老過程受到外界各種因素的干擾，所以衰老研究非常復(fù)雜。 酵母細(xì)胞與人類的體細(xì)胞非常相似，酵母細(xì)胞作為衰老的研究模型具有諸多優(yōu)點(diǎn)：生活周期較短、遺傳背景簡單、基因組已完全破譯，可進(jìn)行遺傳操作，重要的是酵母細(xì)胞內(nèi)與衰老相關(guān)的新陳代謝及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有高度的保守性[2-4]。 幾十年來，酵母細(xì)胞應(yīng)用于衰老方面研究取得了較大進(jìn)展。 在能量限制條件下，酵母細(xì)胞會退出有絲分裂細(xì)胞周期，并獲得一系列特定的靜息細(xì)胞特性以延長壽命，且抗逆性增加[5]。 酵母細(xì)胞內(nèi)激酶（Rim15、Mck1、Yak1）、復(fù)合物SNF1/AMPK、細(xì)胞壁完整性通路以及許多細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子被證明是酵母建立適當(dāng)?shù)撵o息狀態(tài)和延長其時(shí)序壽命所必需的。 此外，研究發(fā)現(xiàn)減少酵母細(xì)胞內(nèi)的毒性氧化物[如活性氧（reactive oxygen species，ROS）]可顯著延長酵母細(xì)胞壽命[6]。 因此，利用酵母細(xì)胞進(jìn)行延衰活性物質(zhì)篩選及其延衰機(jī)理研究，具有可行性和優(yōu)越性。

中國的傳統(tǒng)植物資源豐富，從中尋找高效、低副作用的活性物質(zhì)具有重要的研究價(jià)值。 西洋參又稱美國人參、花旗參，為五加科人參屬植物，其性涼，味甘、微苦，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、清熱（虛火）生津的功效[7]；五味子味酸斂，可益氣斂陰補(bǔ)腎，收耗散之氣[8]；葛根、麥冬和茯苓，具有健脾生津利水的功效[9-11]。 現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，西洋參、五味子、葛根、麥冬和茯苓中均含有諸多抗氧化活性成分（如皂苷、多糖、多酚、氨基酸等），可有效清除衰老過程中的自由基， 減少機(jī)體的氧化損傷，因而具有潛在的延衰功效[12-14]。 但衰老是多組織和器官的問題，涉及的治療靶點(diǎn)往往不止一個(gè)，因而單一活性成分研究已不能滿足其要求。 近年來，基于中醫(yī)藥理論利用各原料進(jìn)行科學(xué)合理的配伍而獲得的組合物及其機(jī)理研究逐漸受到廣泛的關(guān)注，并取得了顯著的成效。 組方的配伍，一方面可以發(fā)揮協(xié)同作用，提高療效以適應(yīng)復(fù)雜多靶點(diǎn)的治療；另外一方面可發(fā)揮拮抗作用，減少不良反應(yīng)以利于治療[15]。基于上述背景，本文將西洋參、五味子、葛根、麥冬和茯苓進(jìn)行組合配比，利用酵母細(xì)胞模型，探討單一原料及其組合物在延緩衰老方面的效果，這將為天然植物活性物質(zhì)在研發(fā)延緩衰老的功能性食品和藥品方面提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酵母細(xì)胞（野生型菌株BY4742、 共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pRS426-pSSA3-RFP 株和共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pRS425-pHsp26-VFP 株） 均由劍橋大學(xué)生物化學(xué)系Nianshu Zhang 教授提供；細(xì)菌培養(yǎng)用酵母抽提物（微生物用）、D-（+）-葡萄糖（生化試劑）、瓊脂（生化試劑）、不含氨基酸的酵母氮堿（微生物用）、甘油（生化試劑）、聚乙二醇4000（生化試劑）、硫酸腺嘌呤、L-鹽酸組氨酸、L-色氨酸、L-亮氨酸、L-鹽酸賴氨酸：BBI Life Science 公司；西洋參片（批號19041705）、葛根（批號Y181008-01）： 安國市一方藥業(yè)有限公司； 五味子（批號181201）： 廣東杏林藥業(yè)有限公司； 茯苓（批號Y180208-01、QKFL181104）： 安徽金寨喬康藥業(yè)有限公司；麥冬（批號180701）：四川新荷花中藥飲片股份有限公司。 蛋白胨（微生物用）、乙酸鋰二水（分析純）、三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸緩沖液（tris-ethylene diamine tetraacetic acid，TE，分析純）：生工生物工程（上海）股份有限公司；丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、肌醇、賴氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、對氨基苯甲酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、纈氨酸：上海源葉生物科技有限公司； 二氫羅丹明123（Dihydrorhodamine 123，DHR123，D1504）、海藻糖酶（2.6U/mg 蛋白）、淀粉葡萄糖苷酶（30 U/mg 蛋白～60 U/mg 蛋白）、葡萄糖檢測試劑盒（GAGO-20）：Sigma-Aldrich 公司；碘代3，3'-二己氧基羰花青試劑盒（3，3'-dihexyloxacarbocyanine Iodide，DiOC6（3））：Abbkine 科技有限公司；乙醇、濃硫酸等試劑均為分析純：廣州從源試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

全溫振蕩培養(yǎng)箱（HZQ-F160）：太倉市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；渦旋混合儀（XW-80A）：麒麟貝爾實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；水浴恒溫振蕩器（THZ-82A）：常州澳華儀器有限公司；分析天平（FA2104N）：上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；高壓滅菌鍋（LDZC-40BI）：上海申安醫(yī)療器械廠；超凈工作臺（SW-CJ）：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；高速冷凍離心機(jī)（H2050R）：長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司； 全功能微孔板檢測酶標(biāo)儀（Synergy H1）：美國伯騰儀器有限公司；流式細(xì)胞儀（CytoFlex）：美國貝克曼庫爾特公司；超聲波清洗器（KQ5200DE）：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料及組合提取物粉末的制備和配制

西洋參、葛根、五味子、麥冬和茯苓提取物制備：稱取原料各100 g，粉碎過60 目篩，以1∶10（g/mL）的料液比加入65%乙醇進(jìn)行微沸回流提取2 h， 過濾后取上清液；過濾后的濾渣繼續(xù)以1∶8（g/mL）的料液比加入65%乙醇進(jìn)行二次微沸回流提取，提取時(shí)間為2 h，過濾棄渣，5 000 r/min 離心15 min，合并濾液，（60±3）℃真空濃縮，冷凍干燥，干燥器避光保存?zhèn)溆谩?/p>

組合提取物制備：將西洋參、麥冬、茯苓、葛根、五味子按4∶2∶3∶4∶3 的質(zhì)量比例分別稱取25、12.5、18.75、25、18.75 g 原料粉末（過60 目篩），混勻，以1∶10（g/mL）的料液比加入65%乙醇進(jìn)行微沸回流提取2 h， 過濾后取上清液；混合物濾渣繼續(xù)以1∶8（g/mL）的料液比加入65%乙醇進(jìn)行二次微沸回流提取，提取時(shí)間為2 h，過濾棄渣，5 000 r/min 離心15 min， 合并濾液，（60 ±3）℃真空濃縮，冷凍干燥，干燥器避光保存?zhèn)溆谩?/p>

提取物液配制：各提取物粉末用液體的酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）溶解成終濃度為2 mg/mL 的母液，此母液經(jīng)0.22 μm 的無菌濾頭過濾，放置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 酵母細(xì)胞培養(yǎng)

接種環(huán)于酒精燈外焰灼燒滅菌后，從裝有野生型菌株（BY4742）的甘油管中蘸取一環(huán)菌液，以平板劃線方式在固體酵母平板YPD 培養(yǎng)基上逐漸稀釋菌液，劃線后的固體平板在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。 取出劃線生長2 d 后的固體YPD 平板， 挑單菌落于裝有5 mL～10 mL YPD 液體培養(yǎng)基的50 mL 試管中， 置于30 ℃、200 r/min 的搖床中過夜培養(yǎng)，用于后續(xù)試驗(yàn)[5]。

1.3.3 酵母細(xì)胞增殖檢測

將過夜培養(yǎng)后的BY4742 菌液以1∶50（體積比）的接種比例接種于含藥物濃度為250、500、1 000 μg/mL的YPD 培養(yǎng)液中，并設(shè)置各自溶劑對照，以200 μL/孔的液體量培養(yǎng)于96 孔板中，每個(gè)濃度設(shè)置4 個(gè)平行復(fù)孔， 于酶標(biāo)儀中， 在30 ℃下以連續(xù)振板方式培養(yǎng)，在OD595nm下每15 min 讀數(shù)一次，培養(yǎng)24 h，計(jì)算代時(shí)（即酵母繁殖一代所需時(shí)間）[5]。

1.3.4 酵母細(xì)胞時(shí)序壽命（chronological lifespan，CLS）檢測

將酵母株按1∶50（體積比）接種在含1 000 μg/mL各原料和組合提取物的酵母氨基酸缺陷型合成培養(yǎng)基（yeast synthetic drop-out medium，SD）中振蕩培養(yǎng)8 d，分別在培養(yǎng)的3 d 和8 d 后取出酵母培養(yǎng)液，采用單克隆計(jì)數(shù)法（colony forming units，CFU）測定干預(yù)后的酵母BY4742 株形成單菌落的能力。 干預(yù)后的酵母細(xì)胞按照1∶10、1∶50 和1∶250 的稀釋梯度不斷稀釋，將最終稀釋125 000 倍的酵母細(xì)胞液涂瓊脂平板，在30 ℃條件的培養(yǎng)箱中生長3 d， 拍照并使用Image J 軟件進(jìn)行單菌落計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。 酵母細(xì)胞的存活率計(jì)算：將每組培養(yǎng)3 d 后的酵母形成單菌落個(gè)數(shù)標(biāo)記為A，培養(yǎng)8 d 后酵母形成單菌落個(gè)數(shù)標(biāo)記為a，3 d 后計(jì)數(shù)得到的單菌落數(shù)酵母細(xì)胞存活率為（A/A×100）%，標(biāo)記為CLS0，此時(shí)各組的CLS0 存活率均為100%，8 d 后酵母細(xì)胞存活率為（a/A×100）%（即為相對CFU%）[16]。

1.3.5 酵母細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測

將酵母株按1∶50（體積比）接種在40 mL 濃度為1 000 μg/mL 的組合提取物培養(yǎng)液中，在30 ℃、200 r/min的搖床中培養(yǎng)。 培養(yǎng)24 h 后，取樣檢測酵母細(xì)胞活性氧水平。 將OD595nm值為0.5～0.6 的酵母培養(yǎng)液，25 ℃、11 000 r/min 離心1 min，收集沉淀酵母細(xì)胞。用200 μL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌1 次，然后重懸于200 μL PBS 中。將50 μL 細(xì)胞加入到含有10 μmol 二氫羅丹明123（DHR 123）的1 mL PBS 中。避光，并在30 ℃下孵育60 min，用200 μL PBS 洗滌細(xì)胞一次，并重懸于1 mL PBS 中。在輕度超聲處理后，使用流式細(xì)胞儀[激發(fā)波長：488 nm，發(fā)射波長：（530±30）nm]檢測細(xì)胞熒光強(qiáng)度[17]。

1.3.6 酵母細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）檢測

將酵母株按1 ∶50（體積比）接種在40 mL 濃度為1000μg/mL 的組合提取物培養(yǎng)液中，在30℃、200 r/min的搖床中培養(yǎng)。 培養(yǎng)24 h 后，取樣檢測酵母細(xì)胞活性氧水平。 將OD595nm值為0.5～0.6 的酵母培養(yǎng)液，25 ℃、11 000 r/min 離心1 min，收集沉淀酵母細(xì)胞，用200 μL PBS 洗滌1 次，然后重懸于200 μL PBS 中。將100 μL細(xì)胞加入到0.9 mL 用PBS 稀釋后終濃度為200 nmol/L DiOC6（3）熒光探針中。 細(xì)胞懸液在30 ℃下避光孵育30 min，用PBS 洗滌一次并重懸于PBS 中，用流式細(xì)胞儀（激發(fā)波長：482 nm，發(fā)射波長：504 nm）中異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）通道檢測細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

1.3.7 酵母細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子Msn2/4、Gis1 和Hsf1激活程度的檢測

利用含2%葡萄糖的酵母基礎(chǔ)培養(yǎng)基（yeast synthetic condition minimal medium，SC） 復(fù)蘇已轉(zhuǎn)化質(zhì)粒（pRS426-pSSA3-RFP 與pRS425-pHsp26-VFP） 的酵母菌株液，30 ℃、200 r/min 過夜培養(yǎng)。 將過夜培養(yǎng)的含質(zhì)粒酵母細(xì)胞以1∶50（體積比）接種在低糖（0.6%葡萄糖）SC 培養(yǎng)基配制的含1 000 μg/mL 組合提取物培養(yǎng)液中，干預(yù)24 h 后利用流式細(xì)胞儀測定酵母細(xì)胞中由啟動(dòng)子控制的應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子Msn2/4、Gis1 和Hsf1 的激活熒光變化。 2 000 r/min 離心5 min 收集干預(yù)后的酵母細(xì)胞，用PBS 清洗1 遍后，再用PBS 重懸。流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，紅色熒光蛋白（red fluorescent protein，RFP）的激發(fā)波長為（580±10）nm，發(fā)射波長為（610±10）nm；綠色熒光蛋白（vivid Verde fluorescent protein，VFP）的激發(fā)波長為（500±10）nm，發(fā)射波長為（540±10）nm[5]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行平行測定3 次，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示，采用Prism 6 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組之間采用t 檢驗(yàn)，多組之間通過方差分析（one way ANOVA）做顯著性分析，p ＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，圖表采用GraphPad Prism 6 進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同原料提取物及組合提取物對酵母細(xì)胞生長的影響

代時(shí)表示酵母細(xì)胞分裂一次所需的時(shí)間，表征酵母細(xì)胞在藥物或者溶劑下的生長情況。 酵母細(xì)胞生長曲線圖見圖1。

如圖1 所示， 酵母細(xì)胞在0～5 h 處于生長的延滯期，即適應(yīng)環(huán)境及慢速生長時(shí)期；5 h～10 h 處在生長對數(shù)期，酵母細(xì)胞汲取營養(yǎng)，營養(yǎng)消耗速率較快，酵母細(xì)胞快速生長，細(xì)胞數(shù)量以指數(shù)形式增加；在12 h 后，酵母細(xì)胞群體達(dá)到穩(wěn)定，處于細(xì)胞生長的穩(wěn)定期，細(xì)胞數(shù)量處于動(dòng)態(tài)變化，整體數(shù)量基本不變。 數(shù)據(jù)處理選取了對數(shù)期（5 h～10 h）細(xì)胞生長數(shù)據(jù)，根據(jù)指數(shù)期生長曲線公式，計(jì)算細(xì)胞生長代時(shí)。

各原料提取物及組合提取物在3 個(gè)濃度（250、500、1 000 μg/mL）下對酵母細(xì)胞生長的影響見圖2。

由圖2 可知， 不同濃度下的西洋參、 五味子、麥冬、葛根及組合提取物對酵母生長沒有明顯的抑制或者促進(jìn)作用（p＞0.05）。 此外，茯苓干預(yù)組在濃度為500 μg/mL～1 000 μg/mL 范圍內(nèi)可顯著抑制酵母細(xì)胞生長（p＜0.05）。

圖2 各原料提取物及組合提取物對酵母細(xì)胞生長的影響Fig.2 Effects of individual extracts and combined extracts on the growth of yeast cells

2.2 不同原料提取物及組合提取物對酵母細(xì)胞時(shí)序壽命的影響

在裂殖酵母中，細(xì)胞壽命可分為兩種形式：一種是復(fù)制壽命（replicative lifespan，RLS），指母細(xì)胞在衰老前可產(chǎn)生子細(xì)胞數(shù)量；另一種是時(shí)序壽命（CLS），指不分裂的細(xì)胞在穩(wěn)定期中所能存活的時(shí)間[18]。 而酵母細(xì)胞時(shí)序壽命形式更能反映哺乳動(dòng)物細(xì)胞在分裂完成后存活的時(shí)間長短，反映哺乳動(dòng)物細(xì)胞壽命，因此，采用時(shí)序壽命指標(biāo)評價(jià)各單一原料提取物及其組合提取物的延衰活性。

試驗(yàn)中檢測了西洋參、五味子、麥冬、茯苓、葛根和組合提取物分別干預(yù)8 d 后，其酵母細(xì)胞存活情況，即形成單克隆菌群的能力，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 各原料提取物及組合提取物對酵母細(xì)胞時(shí)序壽命的影響Fig.3 Effects of individual extracts and combined extracts on the CLS of yeast cells

由圖3 可知，與溶劑組（51.00±3.94）%相比，在組合提取物干預(yù)酵母細(xì)胞8 d 后， 該組的細(xì)胞存活率為（126.81± 5.22）%（p＜0.05）；而五味子、葛根、麥冬、茯苓單一提取物組與溶劑組無顯著性差異（p＞0.05），與組合提取物組存在顯著性差異（p＜0.05）。 這些結(jié)果表明，相比于組合物中各單一提取物，組合提取物可顯著延長酵母細(xì)胞的壽命， 其延衰效果優(yōu)于單一原料，說明組合的原料之間具有潛在的協(xié)同增效作用。 此外，研究發(fā)現(xiàn)，西洋參組的延長酵母時(shí)序壽命效果優(yōu)于其它原料單一成分效果（p＜0.05），這說明組合物中延衰成分可能主要來自于西洋參。

2.3 組合提取物對酵母細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響

文獻(xiàn)報(bào)道指出酵母的壽命與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平等密切相關(guān)[19]。 活性氧（ROS）的產(chǎn)生是造成細(xì)胞氧化損傷的一個(gè)主要原因， 伴隨著衰老的發(fā)生，ROS 的產(chǎn)生逐步增加，引起胞內(nèi)脂質(zhì)、蛋白及核酸等大分子的損傷積累，最終可導(dǎo)致細(xì)胞功能損傷，引起細(xì)胞死亡，而增加細(xì)胞的抗氧化能力可以延長多種生物的壽命[20]。試驗(yàn)采用一種自由基熒光染料羅丹明123（DHR123）檢測胞內(nèi)的ROS 積累情況，根據(jù)活細(xì)胞中熒光的產(chǎn)生情況，可以判斷ROS 含量的多少及變化。 組合提取物處理對酵母細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響見圖4。

圖4 組合提取物處理對酵母細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響Fig.4 Effects of the combined extracts on intracellular ROS levels of yeast cells

如圖4 所示：與溶劑組（100 ± 3.74）%相比，組合提取物可高度顯著降低酵母細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平（82.17±2.48）%（p＜0.001），起到較好的細(xì)胞內(nèi)抗氧化效果。

2.4 組合提取物對酵母細(xì)胞線粒體膜電位的影響

線粒體膜電位（MMP）是評價(jià)線粒體產(chǎn)能作用的重要參數(shù)，是維持氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHO）期間能量儲存過程中的重要因素[21]。 酵母線粒體膜電位的測定選擇一種具細(xì)胞膜滲透性、發(fā)綠色熒光的親脂性探針DiOC6（3）可在低濃度下偏向性選擇染色線粒體。 組合提取物處理對酵母細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的影響見圖5。

由圖5 可知， 組合提取物干預(yù)組的相對熒光強(qiáng)度（54.44±1.23）%高度顯著低于溶劑對照組（100±1.44）%（p＜0.001）。 線粒體膜電位越高，線粒體產(chǎn)生的能量越多，促進(jìn)細(xì)胞能量轉(zhuǎn)化。 因而，組合提取物可通過降低線粒體膜電位， 使酵母產(chǎn)生和釋放的能量顯著減少。越來越多的研究指出， 熱量限制能夠有效延長壽命，這已經(jīng)在多個(gè)物種（如酵母、線蟲、果蠅和猴子等）中得以證實(shí)[5，22-24]。 此外，能量限制可通過整合多個(gè)通路信號，來調(diào)節(jié)酵母細(xì)胞的時(shí)序壽命[5]。 因此，組合提取物可通過調(diào)節(jié)線粒體膜電位以限制酵母細(xì)胞的能量，延長酵母細(xì)胞的時(shí)序壽命。

圖5 組合提取物處理對酵母細(xì)胞內(nèi)膜電位水平的影響Fig.5 Effects of the combined extracts on intracellular MMP levels of yeast cells

2.5 組合提取物對酵母細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子Msn2/4、Gis1 和Hsf1 激活的影響

當(dāng)缺乏葡萄糖或任何其它大量營養(yǎng)物質(zhì)時(shí)，酵母細(xì)胞會退出有絲分裂細(xì)胞周期，并獲得一系列特定于靜息細(xì)胞的特性，以確保其壽命[5]。 由于TOR1Δ 或CH9Δ 缺失所導(dǎo)致酵母細(xì)胞時(shí)序壽命CLS 延長也依賴于Rim15 激酶及其下游效應(yīng)物Msn2/4 和Gis1 來激活應(yīng)激反應(yīng)[25]。 Wei 等[25]預(yù)測除Rim15 激酶外，其它因素也參與了通過限制熱量來調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)和延長壽命的過程。 Zhang 等[5，26]為了便于自動(dòng)識別調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)的這些因子，采用兩種“饑餓”誘導(dǎo)的報(bào)告基因（pHSP12-HSP12-VFP 和pSSA3-RFP）篩選酵母基因組中編碼大多數(shù)“信號”分子的272 個(gè)基因缺失突變體，發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞內(nèi)ROS 的清除（應(yīng)激反應(yīng)）和提供能量的碳水化合物積累（能量）是受到轉(zhuǎn)錄因子Msn2/4、Gis1和Hsf1 的激活調(diào)控的。 轉(zhuǎn)錄因子Msn2/4、Gis1 和Hsf1的激活一方面可抑制酵母細(xì)胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生，另一方面可促進(jìn)酵母細(xì)胞內(nèi)碳水化合物的積累。

為了進(jìn)一步探討組合物延長酵母時(shí)序壽命作用的機(jī)理，本試驗(yàn)中分別采用了兩種不同質(zhì)粒構(gòu)建的報(bào)告基因酵母株（pRS426-pSSA3-RFP 與pRS425-pHsp26-VFP）[5]。 酵母細(xì)胞株中兩種不同啟動(dòng)子連同的報(bào)告基因都被三類應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子靶向：Msn2/4、Gis1 和Hsf1， 而這三類應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子可協(xié)調(diào)抗氧化防御系統(tǒng)和分子伴侶的表達(dá)；并且?guī)в屑t色熒光的RFP 報(bào)告基因或者綠色熒光的VFP 報(bào)告基因的表達(dá)水平高低反映出酵母細(xì)胞中的對應(yīng)激的反應(yīng)程度。 組合提取物對pSSA3-RFP 或pHsp26-VFP 啟動(dòng)子控制的酵母細(xì)胞株內(nèi)應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子Msn2/4、Gis1 和Hsf1 激活的影響見圖6。

圖6 組合提取物對pSSA3-RFP 或pHsp26-VFP 啟動(dòng)子控制的酵母細(xì)胞株內(nèi)應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子Msn2/4、Gis1 和Hsf1 激活的影響Fig.6 Effects of the combined extracts on the activation of Msn2/4，Gis1 and Hsf1 stress transcription factors in two different yeast cells with pSSA3-RFP or pHsp26-VFP promoters

結(jié)果表明（圖6）：與溶劑對照組的相對熒光強(qiáng)度（100%）相比，組合提取物組不僅可顯著激活pSSA3-RFP 啟動(dòng)子控制下酵母細(xì)胞內(nèi)的紅色相對熒光強(qiáng)度顯著增加（151.85 ± 3.50）%（p<0.001），還可促進(jìn)pHsp26-VFP 啟動(dòng)子控制的酵母細(xì)胞內(nèi)綠色相對熒光強(qiáng)度的顯著性增加（154.44±5.13）%（p<0.001）。 同時(shí)，研究結(jié)果中紅色和綠色熒光強(qiáng)度增加強(qiáng)度無顯著差異，說明組合提取物具有較好的激活酵母細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子Msn2/4、Gis1 和Hsf1 的功效。

3 結(jié)論

對數(shù)種植物原料提取物及其組合提取物進(jìn)行篩選后發(fā)現(xiàn)，組合物對酵母細(xì)胞的時(shí)序壽命延長作用最為顯著，在1 000 μg/mL 濃度作用下酵母細(xì)胞存活率可達(dá)（126.81±5.22）%，顯著高于溶劑對照組和各單一原料提取物的存活率，說明組合物延衰效果優(yōu)于組合物中任一單一原料的效果。 試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明，組合提取物可顯著減少酵母細(xì)胞內(nèi)ROS 水平和降低線粒體膜電位，并顯著激活酵母細(xì)胞內(nèi)與應(yīng)激和碳水化合物積累密切相關(guān)的Msn2/4、Gis1 和Hsf1 轉(zhuǎn)錄因子。 通過試驗(yàn)結(jié)果分析可進(jìn)一步推斷，組合物不僅可通過激活細(xì)胞內(nèi)的與抗氧化密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Msn2/4、Gis1 和Hsf1 來清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧，起到抗氧化和延長酵母壽命的作用； 而且可通過激活轉(zhuǎn)錄因子Msn2/4、Gis1 和Hsf1 增加酵母細(xì)胞內(nèi)的碳水化合物積累，降低線粒體膜電位，減少能量產(chǎn)生和釋放，從而起到延長酵母時(shí)序壽命的作用。 這些結(jié)果表明該組方在應(yīng)用于研發(fā)延衰、抗氧化、調(diào)節(jié)線粒體膜功能的食品、功能性食品以及藥品中極具潛力。