低壓貯藏對(duì)楊梅果實(shí)抗氧化及其細(xì)胞膜透性的影響

鄭俊峰，謝建華*，龐杰

（1.漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系，福建 漳州 363000；2.農(nóng)產(chǎn)品深加工及安全福建省高校應(yīng)用技術(shù)工程中心，福建 漳州 363000；3.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

低壓（low-pressure，LP）貯藏屬不凍結(jié)真空保鮮技術(shù)[1]，因其低能耗、無(wú)污染等特點(diǎn)[2-3]，廣泛應(yīng)用于番木瓜[4]、鴨梨[5]、桃[6]、芒果[7]、藍(lán)莓[8]等采后貯藏，具有良好的保鮮效果。 成熟水果采后其抗氧化酶活性易下降，非酶類抗氧化物質(zhì)易流失，機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧自由基不斷增多。 低壓貯藏可為鮮果提供持續(xù)不間斷的“低壓、低溫、高濕、換氣”的貯藏環(huán)境，誘導(dǎo)其內(nèi)源非酶類抗氧化物質(zhì)[如抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）等]和酶類抗氧化物質(zhì)[如過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）等]產(chǎn)生抗氧化，延緩膜脂過(guò)氧化，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，降低生理障礙或病害風(fēng)險(xiǎn)，延長(zhǎng)貯藏壽命[1，9]。

楊梅（Myrica rubra Sieb.et Zucc）原產(chǎn)于我國(guó)，福建、浙江、廣東、江西等長(zhǎng)江以南地區(qū)為主產(chǎn)區(qū)，其果實(shí)色澤鮮艷、酸甜可口、風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者喜歡[10]。 但楊梅成熟期、采收期集中在高溫梅雨季節(jié)，果肉鮮嫩且無(wú)外果皮包裹，采后極不耐貯藏保鮮，易發(fā)生組織衰老、腐爛劣變等問(wèn)題，貨架期短、損耗率大，已嚴(yán)重制約鮮楊梅產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。研究表明，楊梅果實(shí)采后組織衰老、腐爛劣變與活性氧代謝有關(guān)，其代謝失調(diào)可誘導(dǎo)膜脂過(guò)氧化作用加強(qiáng)，細(xì)胞膜透性增加，加速組織衰老腐爛進(jìn)程[11-12]。 目前，對(duì)楊梅果實(shí)采后貯藏保鮮技術(shù)的研究主要集中在貯前減壓預(yù)處理[4]、1-甲基環(huán)丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）和熱處理[13]、NO 處理[14]和低溫貯藏[15]、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）[16]單獨(dú)或復(fù)合使用等方法，而研究低壓貯藏對(duì)楊梅果實(shí)細(xì)胞膜透性與抗氧化關(guān)系，探討其影響衰老腐爛機(jī)制尚較少見報(bào)道。 本試驗(yàn)以“安海變”楊梅果實(shí)為試驗(yàn)材料，2 ℃～4 ℃溫度條件下，設(shè)置常壓貯藏為對(duì)照（control check，CK），研究低壓（LP，0.05 MPa）貯藏對(duì)楊梅果實(shí)的細(xì)胞膜透性及其抗氧化性的影響，并監(jiān)測(cè)貯藏期間細(xì)胞膜透性（cell membrane permeability，CMP）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和內(nèi)源抗氧化物質(zhì)AsA、脯氨酸（proline，Pro），以及SOD、CAT、POD、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）等抗氧化酶有關(guān)生理生化指標(biāo)變化，旨在進(jìn)一步闡明低壓貯藏對(duì)楊梅果實(shí)抗氧化機(jī)制及其對(duì)細(xì)胞膜透性的影響，以期為調(diào)控楊梅果實(shí)采后衰老生理、延長(zhǎng)保鮮期提供理論和實(shí)踐參考。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

以漳州浮宮鎮(zhèn)果園“安海變”楊梅品種為試材，挑選成熟度一致、大小均一、無(wú)碰傷、無(wú)病蟲害的果實(shí)，用厚為0.05 mm 的塑料袋分裝，每袋為500 g 左右，膠帶封口，分兩組進(jìn)行處理：CK 為常壓貯藏于2 ℃～4 ℃條件下；LP 為0.05 MPa 壓力貯藏于2 ℃～4 ℃的溫度條件下。 貯藏期為16 d，每隔4 d 取樣1 次，測(cè)定各項(xiàng)理化指標(biāo)，每項(xiàng)指標(biāo)重復(fù)3 次。

1.2 設(shè)備與試劑

1.2.1 主要設(shè)備

721 型分光光度計(jì)：上海第三分析儀器廠；80-2 型離心機(jī)： 上海浦東物理光學(xué)儀器廠；PHS-25 型電位計(jì)：上海精科雷磁公司。

1.2.2 主要試劑

2，6-二氯靛酚鈉：生工生物工程（上海）股份有限公司；茚三酮：沈陽(yáng)先創(chuàng)化工有限公司；過(guò)氧化氫、乙二胺四乙酸二鈉、曲拉通（TritonX-100）、三氯乙酸：西隴化工股份有限公司；氮藍(lán)四唑（nitroblue tetrazolium，NBT）、甲硫氨酸、核黃素、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）：北京索萊寶科技有限公司。 以上試劑均為分析純。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 AsA 含量測(cè)定

參考GB 5009.86—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中抗壞血酸的測(cè)定》[17]方法，從10 個(gè)果實(shí)中取果肉5 g，研磨均漿離心，提取上清液定容至10 mL，采用2，6-二氯靛酚滴定法測(cè)定楊梅果實(shí)中AsA 含量， 結(jié)果以mg/100 g 表示。

1.3.2 Pro 含量測(cè)定

參考丁改秀等[18]的方法，隨機(jī)取10 個(gè)楊梅果實(shí)，取果肉5 g，研磨勻漿離心，提取上清液定容至10 mL，采用酸性茚三酮法測(cè)定楊梅果實(shí)中Pro 含量， 結(jié)果以mg/100 g 表示。

1.3.3 SOD 活性測(cè)定

參考曹建康等[19]的方法，從10 個(gè)楊梅果實(shí)取果肉5 g，研磨勻漿離心，提取上清液定容至20 mL 得到酶液， 采用NBT 光還原法測(cè)定SOD 活性， 結(jié)果以U/g FW 表示。

1.3.4 CAT 活性測(cè)定

參考SI 等[20]的方法，酶液提取同SOD，采用紫外吸收法測(cè)定CAT 活性，結(jié)果以U/g FW 表示。

1.3.5 POD 活性測(cè)定參考曹建康等[21]的方法，酶液提取同SOD，采用愈創(chuàng)木酚比色法測(cè)定POD 活性，結(jié)果以U/g FW 表示。

1.3.6 PPO 活性測(cè)定參考田世平等[22]的方法，酶液提取同SOD，采用鄰苯二酚比色法測(cè)定PPO 活性，結(jié)果以U/g FW 表示。

1.3.7 MDA 含量測(cè)定

參考李合生[23]的方法加以改進(jìn)，從10 個(gè)楊梅果實(shí)中取果肉2 g，研磨勻漿離心，提取上清液定容至20 mL，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA 含量，結(jié)果以mmol/g表示。

1.3.8 CMP 測(cè)定

參考高俊鳳[24]的方法，取5 個(gè)楊梅果實(shí)放入燒杯，加入400 mL 蒸餾水，采用電導(dǎo)率方法測(cè)定CMP，結(jié)果以%表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2017 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和制圖，采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊梅果實(shí)低壓貯藏過(guò)程中AsA 含量的變化

AsA 是果蔬內(nèi)源抗氧化物質(zhì)， 可清除活性氧（reactive oxygen species，ROS），抑制膜脂過(guò)氧化[25]。 楊梅果實(shí)低壓貯藏過(guò)程中ASA 含量的變化見圖1。

圖1 楊梅果實(shí)低壓貯藏過(guò)程中ASA 含量的變化Fig.1 Changes of AsA content in bayberry fruit during low pressure storage

如圖1 所示，楊梅果實(shí)AsA 含量變化呈先升后降趨勢(shì)，這可能是由于其貯藏前期進(jìn)一步成熟使AsA 含量出現(xiàn)上升，而在后期衰老消耗導(dǎo)致其逐漸下降。 CK在0～4 d 出現(xiàn)上升，第4 天之后快速下降，LP 在0～8 d出現(xiàn)上升，第8 天之后較緩下降，且在8 d～16 d 其AsA含量顯著高于CK（P＜0.05），說(shuō)明低壓貯藏延緩了楊梅果實(shí)AsA 含量峰值的出現(xiàn)，且明顯抑制貯藏后期AsA含量的下降，可有效保持抗氧化能力，抑制楊梅果實(shí)組織膜脂過(guò)氧化。

2.2 楊梅果實(shí)低壓貯藏過(guò)程中Pro 含量的變化

Pro 既是果蔬組織細(xì)胞質(zhì)內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)， 也是內(nèi)源抗氧化劑，可參與清除超氧陰離子自由基（O2-·）和羥基自由基（·OH）[26]。楊梅果實(shí)低壓貯藏過(guò)程中Pro含量的變化見圖2。

圖2 楊梅果實(shí)低壓貯藏過(guò)程中Pro 含量的變化Fig.2 Changes of Pro content in bayberry fruit during low pressure storage

如圖2 所示， 楊梅果實(shí)Pro 含量在貯藏期間呈上升趨勢(shì)，0～8 d，LP 與CK 的楊梅果實(shí)Pro 含量變化均不明顯，CK 的Pro 含量第8 天快速上升，而LP 在8 d～12 d 保持穩(wěn)定，在第12 天后較快上升，且在12 d～16 d顯著低于CK（P＜0.05），說(shuō)明低壓貯藏可明顯延緩楊梅果實(shí)貯藏后期Pro 含量上升，提高其貯藏后期抗氧化能力，減輕氧化傷害。

2.3 楊梅果實(shí)低壓貯藏過(guò)程中SOD 活性的變化

SOD 可將采后果蔬組織中積累的O2-·歧化為過(guò)氧化氫（H2O2）和O2。楊梅果實(shí)低壓貯藏過(guò)程中SOD 活性的變化見圖3。

圖3 楊梅果實(shí)低壓貯藏過(guò)程中SOD 活性的變化Fig.3 Changes of SOD activity in bayberry fruit during low pressure storage

如圖3 所示，CK 的SOD 活性在0～12 d 逐漸上升且高于LP，第12 天達(dá)到峰值后再迅速下降；LP 的SOD活性在0～4 d 出現(xiàn)下降，之后緩慢上升，第16 天高于CK，說(shuō)明低壓可較穩(wěn)定保持楊梅果實(shí)貯藏前中期較低水平SOD 活性， 并使其在貯藏后期保持較高SOD 活性，進(jìn)而減少細(xì)胞內(nèi)O2-·累積，這與王曉丹等[4]、王友升等[27]研究結(jié)果類似。SOD 活性受到O2-·產(chǎn)生速率誘導(dǎo)，研究發(fā)現(xiàn)，LP 的SOD 活性在4 d～12 d 顯著低于CK（P<0.05），這可能是由于低壓貯藏環(huán)境抑制O2-·產(chǎn)生速率，減少O2-·積累，使其SOD 活性保持較低水平[28]。

2.4 楊梅果實(shí)低壓貯藏過(guò)程中CAT 活性的變化

CAT 以H2O2為底物，可將其分解為H2O 和O2。 楊梅果實(shí)低壓貯藏過(guò)程中CAT 活性的變化見圖4。

圖4 楊梅果實(shí)低壓貯藏過(guò)程中CAT 活性的變化Fig.4 Changes of CAT activity in bayberry fruit during low pressure storage

如圖4 所示，楊梅果實(shí)CAT 活性變化呈前降中升后降趨勢(shì)。 冷藏0～12 d 期間，CK 的CAT 活性均高于LP，其中，8 d～12 d，LP 顯著低于CK（P<0.05），這可能是由于低壓貯藏抑制楊梅果實(shí)H2O2生成速率， 減少H2O2積累，使其CAT 活性保持較低水平，這與黃海英等[29]研究結(jié)果一致。CK 和LP 分別于第8、12 天達(dá)到峰值，12 d～16 d，CK 快速下降， 而LP 緩慢下降， 第16天，LP 的CAT 活性高于CK。 說(shuō)明低壓可較穩(wěn)定維持楊梅果實(shí)貯藏前中期較低水平CAT 活性，延遲貯藏中期CAT 活性峰值出現(xiàn)， 抑制貯藏后期CAT 活性快速下降，對(duì)保持CAT 活性具有一定作用。

2.5 楊梅果實(shí)低壓貯藏過(guò)程中POD 活性的變化

POD 是清除自由基的保護(hù)酶[30]。 楊梅果實(shí)低壓貯藏過(guò)程中POD 活性的變化見圖5。

圖5 楊梅果實(shí)低壓貯藏過(guò)程中POD 活性的變化Fig.5 Changes of POD activity in bayberry fruit during low pressure storage

如圖5 所示，CK 和LP 在0～4 d 均緩慢下降，CK在4 d～12 d 較快上升，隨后降低；而LP 在4 d～16 d 緩慢上升，整個(gè)貯藏過(guò)程，LP 的POD 活性均低于CK，且12 d～16 d 差異顯著（P<0.05），這可能與LP 導(dǎo)致楊梅果實(shí)組織內(nèi)自由基積累較少有關(guān)。 說(shuō)明低壓貯藏能較明顯抑制楊梅果實(shí)POD 活性，減輕楊梅果實(shí)膜脂過(guò)氧化程度。

2.6 楊梅果實(shí)低壓貯藏過(guò)程中多酚氧化酶（PPO）活性的變化

PPO 是參與酶促褐變的關(guān)鍵酶。 楊梅果實(shí)低壓貯藏過(guò)程中PPO 活性的變化見圖6。

圖6 楊梅果實(shí)低壓貯藏過(guò)程中PPO 活性的變化Fig.6 Changes of PPO activity in bayberry fruit during low pressure storage

如圖6 所示，CK 的PPO 活性先升后降，第8 天達(dá)到峰值；而整個(gè)貯藏過(guò)程中，LP 在0～12 d 保持較穩(wěn)定水平，隨后逐漸上升，第16 天高于CK，且在4 d～12 d的PPO 活性極顯著低于CK（P<0.01），這可能是由于低壓貯藏環(huán)境有效保持楊梅果實(shí)組織細(xì)胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定，減少其與底物酚類物質(zhì)接觸，且與低壓導(dǎo)致O2的分壓較低有關(guān)。 這說(shuō)明低壓貯藏可明顯抑制楊梅果實(shí)的PPO 活性，延緩采后褐變，減慢生理老化過(guò)程。

2.7 楊梅果實(shí)低壓貯藏過(guò)程中MDA 含量的變化

MDA 是膜脂過(guò)氧化作用的產(chǎn)物，也是評(píng)價(jià)膜脂過(guò)氧化程度的重要指標(biāo)[31]。 楊梅果實(shí)低壓貯藏過(guò)程中MDA 含量的變化見圖7。

圖7 楊梅果實(shí)低壓貯藏過(guò)程中MDA 含量的變化Fig.7 Changes of MDA content in bayberry fruits during low pressure storage

如圖7 所示，MDA 含量呈上升趨勢(shì)，LP 的MDA含量始終低于CK。CK 在0～4 d 上升較慢，之后加快上升，而LP 在0～12 d，上升較慢，第12 天后迅速上升，且在8 d～16 d 顯著低于CK（P<0.05）。 說(shuō)明低壓貯藏明顯延緩MDA 含量上升，減輕楊梅果實(shí)膜脂過(guò)氧化。

2.8 楊梅果實(shí)低壓貯藏過(guò)程中CMP 的變化

果蔬采后貯藏過(guò)程中， 隨后熟衰老進(jìn)程不斷推進(jìn)，其細(xì)胞結(jié)構(gòu)會(huì)受到破壞，從而使CMP 增加。楊梅果實(shí)低壓貯藏過(guò)程中CMP 的變化見圖8。

圖8 楊梅果實(shí)低壓貯藏過(guò)程中CMP 的變化Fig.8 Changes of CMP during low pressure storage of bayberry fruit

如圖8 所示，楊梅果實(shí)的CMP 呈上升趨勢(shì)，但LP的CMP 在整個(gè)貯藏過(guò)程中低于CK， 且在8 d～16 d 顯著低于CK（P<0.05），說(shuō)明低壓貯藏可明顯延緩楊梅果實(shí)CMP 上升，較好維持楊梅果實(shí)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。

2.9 楊梅果實(shí)低壓貯藏過(guò)程中細(xì)胞膜透性（CMP）和抗氧化各指標(biāo)之間的相關(guān)性分析

楊梅果實(shí)低壓貯藏過(guò)程中CMP 和抗氧化各指標(biāo)之間的相關(guān)性分析結(jié)果見表1。

如表1 所示，在低壓貯藏過(guò)程中，楊梅果實(shí)CMP與不同抗氧化指標(biāo)的相關(guān)性不太一致，各抗氧化指標(biāo)之間的相關(guān)性也不太一致。 CMP 與MDA 之間呈顯著正相關(guān)（R=0.902，P<0.05），與POD 之間呈極顯著正相關(guān)（R=1.000，P<0.01）；而MDA 與Pro、PPO 呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），R 值分別為0.990、0.962，與POD呈顯著正相關(guān)（R=0.902，P<0.05），PPO 與SOD、Pro 之間呈顯著正相關(guān)（P<0.05），R 值分別為0.950、0.944，其他指標(biāo)與上述指標(biāo)之間相關(guān)性不顯著。 以上結(jié)果表明， 楊梅果實(shí)CMP 越高， 其MDA、Pro 含量和POD、PPO、SOD 活性就越高。 綜上所述，低壓貯藏誘導(dǎo)楊梅果實(shí)組織降低MDA 積累，延緩細(xì)胞膜透性上升，主要是抗氧化物質(zhì)Pro 和抗氧化相關(guān)酶POD、PPO、SOD 等關(guān)鍵指標(biāo)發(fā)揮主導(dǎo)作用，而AsA、CAT 作用較不明顯。

3 結(jié)論

低壓貯藏可有效抑制引起生鮮園藝產(chǎn)品成熟衰老有關(guān)酶的活性，降低生鮮園藝產(chǎn)品的生理障礙或病害的風(fēng)險(xiǎn)，延長(zhǎng)保鮮期[9]。 本研究結(jié)果表明，采用低壓（LP，0.05 MPa） 貯藏可誘導(dǎo)楊梅果實(shí)啟動(dòng)抗氧化保護(hù)機(jī)制，延緩了其內(nèi)源抗氧化物質(zhì)AsA 高峰出現(xiàn)、限制AsA 含量下降和Pro 含量上升； 延遲Pro 含量急劇上升，有效維持SOD、CAT 活性在貯藏中期逐步上升；在貯藏后期保持較高活性； 可明顯抑制POD 和PPO 活性，提高楊梅果實(shí)低溫逆境抗氧化能力；減輕MDA 積累和膜脂過(guò)氧化程度；明顯延緩CMP 上升，使其在貯藏第16 天時(shí)CMP 仍保持在10%以下。 這說(shuō)明LP 貯藏可較好地保護(hù)楊梅果實(shí)組織細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，有效維持楊梅果實(shí)冷藏期間的正常生理代謝，進(jìn)一步延緩其衰老劣變進(jìn)程。 進(jìn)一步分析楊梅果實(shí)低壓貯藏過(guò)程中CMP 與抗氧化各指標(biāo)之間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，LP 貯藏楊梅果實(shí)CMP 與MDA 之間呈顯著正相關(guān)（R=0.902，P<0.05），與POD 之間呈極顯著正相關(guān)（R=1.000，P<0.01）；而MDA 與Pro、PPO 極顯著正相關(guān)（P<0.01），R 值分別為0.990、0.962，與POD 呈顯著正相關(guān)（R=0.902，P<0.05），PPO 與SOD、Pro 之間呈顯著正相關(guān)（P<0.05），R 值為0.950、0.944，其他指標(biāo)與上述指標(biāo)之間相關(guān)性不顯著。這說(shuō)明低壓貯藏楊梅果實(shí)抗氧化機(jī)理主要是通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)源抗氧化物質(zhì)Pro 和抗氧化相關(guān)酶POD、PPO、SOD 等關(guān)鍵指標(biāo)，從而降低果實(shí)MDA 積累，延緩CMP上升， 而AsA、CAT 在楊梅果實(shí)低壓貯藏過(guò)程中的作用較不明顯。 其研究結(jié)果可為后續(xù)開發(fā)楊梅果實(shí)低壓貯藏保鮮技術(shù)提供理論參考和實(shí)踐指導(dǎo)。

低壓貯藏保鮮技術(shù)是一項(xiàng)復(fù)雜的系統(tǒng)工程，涉及持續(xù)低分壓O2、CO2、NH3、C2H4等氣體環(huán)境和低溫、高濕、換氣等技術(shù)因素，其誘導(dǎo)活性氧代謝的應(yīng)激反應(yīng)、能量代謝的響應(yīng)以及延緩后熟衰老進(jìn)程等更深層次機(jī)制有待深入探討研究，同時(shí)還要解決好減壓、冷藏、加濕換氣等設(shè)施的技術(shù)工藝及參數(shù)匹配問(wèn)題，在研究和實(shí)踐中不斷完善，以期獲得更加廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用。