TRPM8 參與薄荷醇對炎癥因子負調控作用的機制

余 煊杜力軍秦 川*

(1.中國醫學科學院醫學實驗動物研究所,北京協和醫學院比較醫學中心,衛健委人類疾病比較醫學重點實驗室,北京市人類重大疾病實驗動物模型工程技術研究中心,北京 100021;2.清華大學蛋白質科學教育部重點實驗室,生命科學學院醫學院藥物藥理實驗室,北京 100084)

薄荷(Mentha haplocalyx Briq),作為重要的藥用植物,在我國種植和使用歷史源遠流長。 其命名有“菝葀”(揚雄·甘泉賦),“茇艸舌”(呂沉·字林),“番荷”(孫思邈·千金方),“菝蘭”(陳士良·食性本草),直至李時珍的本草綱目中才稱作“簿荷”[1]。薄荷在歐洲醫學和西方醫學的推廣使用則要到18世紀后。 薄荷醇(menthol),也稱為薄荷腦,是一種環類單萜,主要存在于薄荷屬草本植物,被用于胃腸道[2-3]、呼吸道[4]、泌尿生殖系統[5]炎癥的治療。薄荷醇與薄荷酮、異薄荷酮、一起賦予薄荷屬植物新鮮和清涼的氣味。 薄荷醇有4 對光學異構體,其中(-)-薄荷醇從薄荷草藥中分離出來,擁有清新的薄荷味和多種藥理學活性,包括鎮咳[6]、鎮痛[7]、止癢[8]、抗菌[9]、抗炎[10-12]、抗腫瘤[13-14]等(圖 1)。

瞬時受體電位 TRPM8 ( transient receptor potential melastatin-related 8),又稱冷和薄荷醇誘導受體CMR-1(cold and menthol induced receptor-1),屬于瞬時受體電位(transient receptor potential,TRP)家族[15-16]。 TRPM8 是一個具有六次跨膜結構域的非選擇性陽離子通道,N 末端和C 末端位于胞內(圖1),可以被冷和具有冷屬性的化合物激活,如薄荷醇、Icilin、桉樹油等[17-20]。

圖1 薄荷醇和TRPM8Note. N, Amino terminal. C, Carboxyl terminal.Figure 1 Menthol and TRPM8

炎癥反應是一個復雜的生物學過程,當機體暴露于感染性病原體,或遭遇物理或化學損傷時發生的一種防御反應。 神經系統炎癥會影響神經系統的功能,強迫癥[21]、阿爾茲海默癥[22]、中風[23]、創傷性腦損傷[24]等疾病都伴隨神經系統的慢性炎癥。目前有多個研究工作,通過小鼠模型或細胞模型表明薄荷醇對炎癥反應的一直與TRPM8 受體相關。Ramachandran 等[25]發現,在小鼠結腸炎模型中,薄荷醇和Icilin(TRPM8 激動劑)對小鼠結腸炎癥反應有緩解作用。 Juergens 等[26]發現 L-薄荷醇在體外可以顯著抑制單核細胞產生PGE、LTB,IL-1β 等炎癥因子的釋放。 除了薄荷醇,其他一些可以激活TRPM8 受體的因素,如低溫[27]、Icilin[28]、桉樹油[29]等,據研究報道也對炎癥反應具有抑制作用。 本研究工作通過小鼠模型和細胞模型,主要探討了薄荷醇對神經系統炎癥的抑制作用及其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

本實驗使用SPF 級ICR 雄性8 周齡小鼠購自華阜康公司[SCXK(京)2019-0008],體重約22 g,共24 只。 實驗小鼠飼養于中國醫學科學院醫學實驗動物研究所小鼠SPF 屏障設施[SYXK(京)2018-0019],恒溫恒濕,12 h/12 h 固定明暗周期,提供充足的無菌飲水、墊料和食物。 本研究工作中涉及的動物實驗內容和所需動物數量通過中國醫學科學院醫學實驗動物研究所倫理審查委員會的審批(IACUC QC18002),并按實驗動物使用的3R 原則給予人道的關懷。

1.1.2 實驗細胞

大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤(PC12 細胞),購自ATCC。

1.2 主要試劑與儀器

(-)-薄荷醇(63660-1G)和DMSO 購自Sigma Aldrich(美國);ECL 底物檢測試劑盒(10095983)和蛋白質 Marker 購自 Thermo-Scientific;0.9% NaCl、PBS 和鈣離子熒光探針Fluo-3AM、RIPA 蛋白裂解液(P0013B)、BCA 蛋白濃度測定試劑盒(增強型P0010)、蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE 預混液、蛋白電泳液、半干轉電轉緩沖液、TBST、封閉液購自碧云天生物技術有限公司;動物組織總RNA 提取試劑盒(DP451)購自天根生化有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物和細胞分組

24 只小鼠,隨機分為對照組(C),溶媒對照組(VC,含0.1% DMSO 生理鹽水),薄荷醇高劑量組(50 mg/kg)和薄荷醇低劑量組(10 mg/kg),通過尾靜脈注射方式進行給藥。 90 min 后,頸椎脫臼處死小鼠,解剖取材獲得小鼠腦組織,分離下丘腦核團部分,液氮速冷后-80℃低溫保存。

PC12 細胞分為空白對照組、薄荷醇給藥組(低劑量200 nmol/L 和高劑量500 nmol/L)。 給藥3 h后,收集細胞,進行RNA 和蛋白抽提。

1.3.2 鈣成像實驗

鈣離子熒光探針Fluo-3AM(5 mmol/L)以PBS稀釋至1 μmol/L 工作液。 細胞培養皿吸盡培養基后,用無菌 PBS 清洗3 次,清除殘留血清后,加入Fluo-3AM 工作液于37℃避光孵育15 min,然后用無菌PBS 清洗 3 遍。 用激光共聚焦顯微鏡(Leica SP8)選取合適的視野進行拍照。 所得圖片結果,進行熒光強度統計分析。

1.3.3 熒光實時定量PCR

動物組織總RNA 提取試劑盒提取小鼠腦組織樣本和PC12 細胞樣本的總RNA,NanoDrop 分光光度檢測所提RNA 濃度和純度。 FastKing 一步法反轉錄-熒光定量試劑盒(SYBR Green) (天根,FP313)進行逆轉錄PCR 和熒光實時定量PCR。 反應體系為:①2×FastKing RT-qPCR Buffer (SYBR Green) 25 μL,②25×RT-PCR Enzyme Mix 2 μL,上下游引物(10 μmol/L)各 1.25 μL,③RNase-Free ddH2O 將總體系補齊至50 μL。 反應步驟:①逆轉錄,50℃,30 min;②預變性,95℃,3 min;③PCR 擴增,95℃,15 s → 60℃,30 s,40 個循環;④溶解曲線分析。 引物序列如表1 所示。

表1 Real-time PCR 引物設計Table 1 Primers for Real-time PCR

1.3.4 免疫熒光標記

將處于生長對數期的PC12 細胞接種至24 孔板(密度約為15%),分為對照組和薄荷醇高劑量組(500 nmol/L),細胞貼壁生長至40%左右時進行給藥處理。 藥物處理后的細胞以4%多聚甲醛固定液室溫固定,隨后加入0.1%的TritionTM-X-100 通透。以1%的BSA 進行封閉,隨后加入目標基因一抗和二抗孵育,二抗孵育時注意避光。 熒光標記后的細胞,置于激光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照。 所得結果可進行熒光強度統計分析。 進行免疫熒光雙標記時,按如下順序進行:表達量較低的蛋白一抗→二抗孵育→二次封閉→表達量較高的蛋白一抗→二抗孵育。

1.3.5 蛋白免疫印記

使用RIPA 蛋白裂解液進行組織或細胞樣本的蛋白質抽提,使用BCA 蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白濃度測定。 免疫熒光和蛋白免疫印跡中使用的抗體見表2。

表2 免疫熒光和蛋白免疫印跡抗體Table 2 Antibodies for Western blot and IF

1.4 統計學方法

本研究數據使用SPSS 22.0 軟件進行統計分析,所有數值以平均數±標準差()表示。 所得數據符合正態分布時,對組內前后差異比較采用配對樣本t檢驗,組間差異比較采用獨立樣本t檢驗。*P<0.05 為差異有統計學意義,**P<0.01 為差異有顯著統計學意義,***P<0.001 為差異有極顯著統計學意義。

2 結果

2.1 薄荷醇對小鼠下丘腦中TRPM8 蛋白表達的調控作用

下丘腦(hypothalamus)屬于機體的中樞神經系統,分布于下丘腦不同區域的神經元通過對溫度、滲透壓、血糖等因子的敏感,參與體溫調節、攝食飲水、內分泌、情緒反應等眾多生理活動。 分布于外周神經系統的TRPM8 是機體的溫度感受器,對冷和薄荷醇敏感。 我們通過體內實驗,檢測位于中樞神經系統的TRPM8 是否對薄荷醇敏感。

如圖2 所示,ICR 小鼠經尾靜脈注射薄荷醇3 h后,通過蛋白免疫印跡檢測小鼠下丘腦中瞬時受體電位TRPM8、核轉錄因子NF-κB 和炎癥因子TNF-α表達的變化。 結果顯示,相比對照組,薄荷醇高劑量(50 mg/kg)和低劑量(10 mg/kg)組小鼠下丘腦中TRPM8 蛋白的表達顯著上調(P<0.01),NF-κB和TNF-α 蛋白的表達顯著下調(P<0.01)。

圖2 注射薄荷醇小鼠蛋白表達情況Note. C, Control group. VC, Vehicle control group. Compared with control group,**P<0.01.Figure 2 Protein expression of mice injected with menthol

2.2 PC12 細胞對薄荷醇的響應

高度分化的PC12 細胞是具有神經元生物特性的神經元樣細胞,被廣泛用于神經毒性、神經保護、神經分泌、神經炎癥和突觸損傷等多個領域的研究工作,是神經生物學體外實驗中理想的細胞模型[30-32]。 微 管 相 關 蛋 白 (microtubule-associated protein-2)是神經元細胞的骨架蛋白,參與神經系統發育、形成和再生等重要生物過程[33]。 如圖3A 所示,在PC12 細胞中進行神經元標志物MAP2 的原位表達,結果顯示,本研究工作中使用的PC12 已經分化為具有神經元特性的細胞。

隨后,通過鈣成像技術,我們在檢測薄荷醇對PC12 細胞的作用。 Fluo-3 AM 是常用的鈣離子熒光探針之一,游離形式的Fluo3 不具有熒光特性,與細胞中的鈣離子結合后會產生較強的熒光。 如圖3B 所示,在 488 nm 激發光下,薄荷醇(200 nmol/L)在PC12 細胞中引發強烈的鈣內流反應。通過平均熒光強度分析顯示,相比對照組(MFI:61.07± 5.01),薄荷醇組的平均熒光強度為(158.29±14.07),與對照組相比具有極顯著差異(P< 0.001)。 上述結果表明,具有神經元屬性的PC12 細胞可以很好的模擬小鼠下丘腦中神經元細胞對薄荷醇的響應。

圖3 薄荷醇處理PC12 細胞Note. Compared with control group,***P<0.001. Menthol concentration, 200 nmol/L.Figure 3 PC12 cells with menthol

2.3 薄荷醇對PC12 細胞中TRPM8 表達的調控作用

通過熒光實時定量PCR,在mRNA 水平檢測薄荷醇對 PC12 細胞中 TPRM8、NF-κB 和 TNF-α 表達的變化。 結果如圖4A~4C 所示,200 nmol/L 和500 nmol/L 的薄荷醇均可以促進TRPM8 的表達,同時下調 NF-κB 和 TNF-α 的轉錄水平。 薄荷醇在轉錄水平對 TRPM8,NF-κB 和 TNF-α 表達的調控作用呈現劑量相關性。

借助免疫熒光雙標記實驗,分別使用FITC(綠色)標記細胞中的TRPM8 蛋白,Alex649 (紅色)標記細胞中的TNF-α 蛋白,結果如圖4D~4E 顯示,相比對照組,給藥組(薄荷醇 500 nmol/L)中TRPM8(綠色)的平均熒光強度顯著升高,TNF-α(紅色)的平均熒光強度下降。 以上結果表明,在mRNA 和蛋白水平,薄荷醇對TRPM8 的表達具有激活作用,對TNF-α 的表達具有抑制作用。

圖4 薄荷醇對基因表達的影響Note. D/E, Menthol concentration, 500 nmol/L. Compared with control group,*P<0.05,**P<0.01.Figure 4 Effect of menthol on the gene expression

2.4 薄荷醇對 PC12 細胞(TRPM8 敲低)中相關基因表達的調控作用

為了進一步驗證TRPM8 蛋白與TNF-α 的負相關性,我們使用 TRPM8 敲低的 PC12 細胞(KD 細胞)進行實驗。 KD 細胞由清華大學藥理實驗室提前構建提供。 如圖5A 所示,在KD 細胞中,TRPM8(紅色)的熒光強度顯著減弱,表明細胞中TPRM8蛋白含量降低。 所以我們進一步比較了薄荷醇在野生型 PC12 細胞(WT 細胞) 和 KD 細胞中對TRPM8 和 TNF-α 表達的影響,結果如圖 5B~5D 所示,在加入200 nmol/L 和500 nmol/L 薄荷醇時,KD細胞中,薄荷醇不能激活細胞中TRPM8 的表達,同時,薄荷醇失去對細胞中 NF-κB 和 TNF-α 的抑制作用,并且激活了 TNF-α 表達(P< 0.01)。 這一結果證實,在TRPM8 的表達降低后薄荷醇對TRPM8 和TNF-α 的負調控作用受到影響。

圖5 薄荷醇對TRPM8 敲低細胞作用Note. WT, Wild type PC12 cells. KD, PC12 cells with TRPM8 knockdown. C, Control group. Compared with control group,**P<0.01.Figure 5 Effect of menthol on TRPM8 knockdown cells

3 討論

TRPM8 是一種重要的溫度感受器受體,環境低溫通過激活分布于外周神經系統的TRPM8 受體,引起鈣離子內流,進一步通過電興奮將環境溫度變化信息傳遞至中樞神經系統,產生相應溫度變化的“冷感覺”。 除了低溫,TRPM8 受體還可以被薄荷醇及其類似激活,同樣通過電興奮,產生“冷感覺”。已有的研究表明,在腦缺血、顱腦外傷、心臟驟停等疾病中,適當降低機體體溫,有利于抑制炎癥反應。長期以來,薄荷醇作為一種天然小分子藥物因其抗炎鎮痛的效應被廣泛使用。 同時,低溫和薄荷醇都可以抑制炎癥反應。 因此,在本研究工作中,我們主要探討了薄荷醇對炎癥反應的抑制作用是否與其對冷敏感受體TRPM8 的激活相關。

我們在體內實驗(小鼠模型)和體外實驗(PC12細胞模型)中都發現,薄荷醇可以促進TRPM8 的表達,抑制 NF-κB 和 TNF-α 的表達。 進一步,PC12 細胞中當 TRPM8 的表達降低,薄荷醇無法激活TRPM8,進一步改變對TNF-α 表達的作用。 這證實了薄荷醇對炎癥因子的抑制作用依賴于其對TRPM8 的激活作用。 此外,在細胞模型中,我們還發現薄荷醇對TRPM8 的激活包括兩個層面:1)一方面,薄荷醇可以誘導PC12 細胞產生鈣內流現象,激活位于細胞膜的TRPM8 作為膜受體的離子通道屬性。 2)分子層面,通過免疫熒光成像,可以直觀的檢測到PC12 細胞胞漿中TRPM8 蛋白表達水平被薄荷醇上調。 分布于細胞膜表面和胞漿中的TRPM8 蛋白具有不同的生物學特點,位于胞漿中的TRPM8 蛋白可能作為信號分子,影響下游基因的轉錄表達[34]。

NF-κB 作為重要的核轉錄因子,廣泛表達于哺乳動物組織細胞中,主要參與機體對外界刺激的響應,在免疫應答和炎癥反應中具有重要作用。 分布于胞漿的NF-κB 與IκB 結合形成無活性的二聚體,當受到細胞外信號激活時,IκB 激酶 IKK 被激活,IκB 降解后使 NF-κB 從 NF-κB-IκBs 復合物中解離,游離的NF-κB 進入細胞核啟動下游基因的轉錄表達[35-36]。 在實驗中我們發現,無論是在小鼠還是細胞模型中,薄荷醇對 NF-κB 和 TNF-α 表達的調控具有相同趨勢。 薄荷醇可以激活胞漿中TPRM8 的表達,位于胞漿中的 TRPM8 蛋白與 NF-κB 蛋白具有共同的空間,因此薄荷醇激活TRPM8 對 TNF-α 的負調控作用可能有核轉錄因子NF-κB 介導。 綜上所述,薄荷醇能夠激活TRPM8,并通過TRPM8 影響了核轉錄因子 NF-κB 及其下游炎癥因子 TNF-α。該結果為薄荷醇抑制炎癥反應可能的分子機制提供了一定的理論依據和思考方向,為薄荷醇的臨床應用提供了研究基礎。