基于LIGHT/HVEM 通路研究白藜蘆醇對子癇前期大鼠腎損傷的保護作用研究

符海內汪洪林張林靜張 蕾符大天

(1.海南省婦幼保健院(海南省婦女兒童醫學中心)婦產科,海口 570206;2.海南省婦幼保健院(海南省婦女兒童醫學中心)藥劑科,海口 570206;3.海南醫學院第一附屬醫院藥劑科,海口 570102)

子癇前期(preeclampsia,PE)是指妊娠期間特有的嚴重并發癥,以血壓升高、蛋白尿及腎損傷等為最主要病理表現的疾病[1-2]。 PE 發病率較高,是導致孕產婦和圍生兒患病及死亡的主要原因之一,可累及全身多器官系統,腎是其損傷的主要靶器官之一[3-4]。 PE 機制復雜,是臨床研究的熱點之一。近來研究發現, 淋巴毒素類似物(lymphotoxin analog,LIGHT)/皰疹病毒介入體(herpes virus entry mediator,HVEM)不僅可調節線粒體功能,參與胰島細胞、腫瘤細胞及神經細胞的損傷[5-6],還可通過調節免疫炎癥反應,參與腎損傷過程[7-8]。 但LIGHT/HVEM 是否參與調控PE 腎損傷過程,還未見報道。白藜蘆醇(Resveratrol,RSV)是從葡萄、藜蘆、虎杖等植物中提取的一種芪類結構的非黃酮類多酚化合物,具有抗腫瘤、抗心血管疾病、抗炎免疫和雌激素樣活性等藥理作用,對冠心病、阿爾茨海默病、糖尿病腎病等多種疾病具有明顯的改善作用[9-10]。 但RSV 對PE 腎損傷的保護作用未見報道。 本研究建立大鼠PE 腎損傷模型,通過阻斷LIGHT/HVEM 通路表達,探討RSV 對PE 腎損傷的保護機制,為臨床合理用藥提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級同遺傳背景SD 大鼠,雄性30 只,雌性60 只,8 周齡,體重200~220 g,購自廣東省醫學實驗動物中心[SCXK(粵)2019-0002],所有大鼠于海南省婦女兒童醫學中心實驗室中進行常規飼養[SYXK(瓊)2019-0012],大鼠在室溫,50%相對濕度的環境下自由飲食進水。 本實驗經醫院倫理委員會批準(IACUC-01(20190916)),實驗嚴格遵循3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

白藜蘆醇(原料藥,高效液相色譜(HPLC)純度99%,批號:D0051,購自上海寶曼生物科技有限公司);亞硝基左旋精氨酸甲酯(L-nitro arginine methyl ester,L-NAME) 試劑(HPLC 純度≥98%,批號:MB3015,購自美侖生物科技有限公司);淋巴毒素β受體(lymphotoxin β receptor,LTβR-Ig)融合蛋白(批號:YBA481Hu01,購自上海鈺博生物科技有限公司);蘇木精-伊紅(HE)染色液(批號:G1120,購自北京索萊寶科技有限公司);血清肌酐(serum creatinine,Scr)、 酶 聯 免 疫 吸 附 (enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 試劑盒(批號:LM-12785-ES,購自上海聯邁生物工程有限公司);血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、ELISA 試劑盒(批號:LM-13351-ES,購自上海聯邁生物工程有限公司);尿蛋白ELISA 試劑盒(批號:JS15437,購自青島捷世康生物科技有限公司);TRIzol 試劑盒、逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR 試劑盒、蛋白提取試劑盒(批號分別為:R0024FT、D7176M、C0298S、SF1009,均購自碧云天生物技術研究所);LIGHT 抗體、HVEM 抗體、核轉錄因子-κB(NF-κB)抗體、白細胞介素-6(IL-6)、β-actin 抗體、HRP 羊抗鼠二抗(批號 分 別 為: ab134930、 ab185711、 ab209795、ab233706、ab101123、ab13055,均購自美國 Abcam 公司);智能無創血壓計(型號:BP-2010A,購自北京軟隆生物技術有限公司);光學顯微鏡(型號:SMZ745,購自日本尼康公司);實時熒光定量PCR 儀(型號:SLAN-96P,購自上海宏石醫療科技有限公司);凝膠成像儀(型號:GIS-500,購自杭州米歐儀器有限公司)等。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠PE 模型建立及分組給藥

取大鼠雄性 30 只,雌性 60 只,按 2 ∶1合籠過夜,所有雌性大鼠于次日早晨發現有陰道栓者視為受孕成功,并將其定為妊娠第1 天,取受孕大鼠50只,隨機分為正常孕鼠組(Normal 組)、子癇前期模型組(PE 組)、白藜蘆醇(RSV)低(50mg/kg)、高(200 mg/kg)劑量組、LIGHT/HVEM 通路阻斷劑(淋巴毒素 β 受體,LTβR-Ig 融合蛋白,1600 μg/kg,LTβR-Ig 組),每組 10 只;除 Normal 組外,其余大鼠均參照文獻[11]方法建立PE 模型:雌性大鼠在妊娠第10 天,按300 mg/kg 的劑量腹腔注射L-NAME 溶液5 d,每天1 次,建立PE 模型,并通過測血壓、24 h尿蛋白和透射電鏡法觀察腎結構確認子癇前期大鼠造模成功。 造模成功后開始給藥,RSV 低、高劑量組參照文獻[12]設置劑量,并用生理鹽水配成5 mg/mL、20 mg/mL 的溶液,按 10 mL/kg 劑量灌胃給藥;LTβR-Ig 組參照文獻[13]設置劑量,并用生理鹽水配成 16 μg/μL 溶液,按 100 μL/kg 劑量經尾靜脈注射給藥;Normal 組和PE 組灌胃+尾靜脈注射給予等量生理鹽水;各組連續給藥5 d,每天1 次。

1.3.2 大鼠血壓及妊娠情況觀察

末次給藥12 h 后,觀察妊娠情況,有無流產現象。 將大鼠置于系統固定容器內,于封閉安靜環境中,接好智能無創血壓計電源并打開主機,設定溫度至39℃,將感應器固定于大鼠尾根部(松緊適度),待大鼠安靜后,用尾套充氣系統自動加壓放氣,并于血壓儀顯示屏上,觀察血壓波形變化并記錄,每只大鼠測量時間為30 min。

1.3.3 標本采集

末次給藥24 h 后,收集尿液置于-80℃冰箱保存。 麻醉大鼠,取腹主動脈血 3 mL,4℃靜置 30 min,3000 r/min 離心10 min,取上清液置于-80℃冰箱保存。 處死大鼠,取左腎組織,剪取部分組織,置于-80℃保存;其余組織迅速置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h,經脫水、透明、浸蠟包埋后切成4 μm切片,備用。

1.3.4 腎組織HE 染色

取1.3.3 項下石蠟切片,按HE 試劑盒說明書方法染色后,在顯微鏡下觀察腎組織變化。

1.3.5 各組大鼠腎功能指標血清肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)及尿液中24 h 尿蛋白量

取血清和尿液標本,按ELISA 試劑盒說明方法檢測Scr、BUN 及尿蛋白含量,具體操作按說明書方法進行。

1.3.6 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)檢測各組大鼠腎組織LIGHT mRNA、HVEM mRNA相對表達水平

取-80℃保存的左腎組織,4℃解凍,機械勻漿分離后取上清液,TRIzol 法抽提總RNA,以總RNA為模板逆轉錄合成cDNA,PCR 試劑盒進行擴增,94℃ 1 min,94℃ 20 s,60℃ 20 s,72℃ 25 s,共進行36 個循環,嚴格按試劑盒說明建立反應體系,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物設計見表 1。 以 β-actin 為內參基因,采用 2-ΔΔCt算法計算LIGHT mRNA、HVEM mRNA 相對表達量。

表1 qRT-PCR 引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

1.3.7 蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測腎組織LIGHT、HVEM、NF-κB、IL-6 蛋白相對表達水平

取-80℃保存的腎組織,4℃解凍后,機械勻漿分離取上清液,提取蛋白,BCA 法測蛋白總濃度后,取50 μg 蛋白行電泳和轉膜反應,滴加5%脫脂牛奶37℃ 封閉 1 h,滴加[LIGHT(1 ∶1000)、HVEM(1 ∶1000)、NF-κB(1 ∶1000)、IL-6(1 ∶1000)、β-actin(內參)(1 ∶2000)]一抗 4℃孵育過夜,滴加二抗(1 ∶2000),37℃孵育1 h,增強化學發光法顯色,凝膠成像儀觀察拍照,以Image J 軟件分析計算蛋白相對表達水平。

1.4 統計學方法

以SPSS 22.0 軟件對實驗數據進行統計分析,計量資料以平均數±標準差()表示,多組間比較進行單因素方差分析,進一步兩組間比較行SNK-q檢驗,P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血壓及妊娠情況觀察結果

與Normal 組相比,PE 組大鼠血壓稍有升高,但升高不明顯,且受孕20 d 時,有3 只大鼠流產;與PE 組相比,RSV 低、高劑量組、LTβR-Ig 組大鼠血壓變化均不明顯,且無流產現象。

2.2 各組大鼠腎功能指標血清Scr、BUN 及尿液中24 h 尿蛋白量檢測結果

與 Normal 組相比,PE 組大鼠血清 Scr、BUN 及尿液中24 h 尿蛋白量升高(P<0.05);與PE 組相比,RSV 低、高劑量組、LTβR-Ig 組大鼠血清 Scr、BUN 及尿液中24 h 尿蛋白量降低(P<0.05),且RSV 高劑量組大鼠血清Scr、BUN 及尿液中24 h 尿蛋白量均低于RSV 低劑量組;LTβR-Ig 組與RSV 高劑量組上述指標比較差異不顯著(P>0.05)。 見表2。

表2 各組大鼠血清Scr、BUN 及尿液中24 h尿蛋白量比較( ,n=10)Table 2 Comparison of serum Scr, BUN and 24 h urine protein in rats of each group

表2 各組大鼠血清Scr、BUN 及尿液中24 h尿蛋白量比較( ,n=10)Table 2 Comparison of serum Scr, BUN and 24 h urine protein in rats of each group

注:與 Normal 組相比,aP<0.05;與 PE 組相比,bP<0.05;與 RSV 低劑量組相比,cP<0.05。Note. Compared with Normal group,aP < 0.05. Compared with PE group,bP < 0.05. Compared with RSV low dose group,cP < 0.05.

組別Groups Scr(μmol/L)BUN(μmol/L)尿液中24 h尿蛋(mg)24 h urinary protein in urine Normal 組Normal group 3.09±0.11 10.86±1.29 16.03±2.01 PE 組PE group 5.98±0.14a 39.61±2.12a 120.21±3.24a RSV 低劑量組RSV low dose group 4.89±0.13ab 30.32±1.82ab 99.16±3.03ab RSV 高劑量組RSV high dose group 4.41±0.12abc 26.67±1.36abc 63.19±2.52abc LTβR-Ig 組LTβR-Ig group 4.46±0.11abc 27.78±1.39abc 64.14±2.28abc

2.3 各組大鼠腎組織HE 染色結果

Normal 組大鼠腎組織形態正常。 與 Normal組相比,PE 組大鼠腎組織可見腎小球內皮細胞彌漫性增生、腫脹、空泡樣變性,基底膜增厚及炎性浸潤等病理損傷。 與PE 組相比,RSV 低、高劑量組、LTβR-Ig 組大鼠上述病理損傷程度逐漸減輕。 見圖 1。

圖1 各組大鼠腎組織HE 染色圖Note. A, Normal group. B,PE group. C,RSV low dose group. D,RSV high dose group. E, LTβR-Ig group.The same as below.Figure 1 HE staining of renal tissue in each group

2.4 各組大鼠腎組織 LIGHT mRNA、HVEM mRNA 相對水平檢測結果

與 Normal 組相比,PE 組大鼠腎組織 LIGHT mRNA、HVEM mRNA 相對水平升高(P<0.05);與PE 組相比,RSV 低、高劑量組、LTβR-Ig 組大鼠腎組織LIGHT mRNA、HVEM mRNA 相對水平降低(P<0.05),且RSV 高劑量組大鼠腎組織LIGHT mRNA、HVEM mRNA 相對水平均低于 RSV 低劑量組;LTβR-Ig 組與RSV 高劑量組,上述指標比較差異不顯著(P>0.05)。 見圖 2。

圖2 各組大鼠腎組織LIGHT mRNA、HVEM mRNA相對水平比較( x- ±s,n=10)Note. Compared with Normal group,aP < 0.05. Compared with PE group,bP < 0.05. Compared with RSV low dose group,cP < 0.05.The same as below.Figure 2 Comparison of the relative levels of LIGHT mRNA and HVEM mRNA in kidney tissue of rats in each group

2.5 各組大鼠腎組織 LIGHT、HVEM、NF-κB、IL-6 蛋白表達結果

與 Normal 組相比,PE 組大鼠腎組織 LIGHT、HVEM、NF-κB、IL-6 蛋白表達升高(P<0.05);與 PE組相比,RSV 低、高劑量組、LTβR-Ig 組大鼠腎組織LIGHT、HVEM、NF-κB、IL-6 蛋白降低(P<0.05),且RSV 高劑量組大鼠腎組織 LIGHT、HVEM、NF-κB、IL-6 蛋白均低于 RSV 低劑量組,LTβR-Ig 組與 RSV高劑量組上述指標比較差異不顯著(P>0.05)。 見圖 3、圖 4。

圖3 各組大鼠腎組織LIGHT、HVEM、NF-κB、IL-6 蛋白表達免疫印跡圖Figure 3 Western blot of LIGHT, HVEM, NF-κB and IL-6 protein expression in renal tissue of rats in each group

圖4 各組大鼠腎組織LIGHT、HVEM、NF-κB、IL-6 蛋白相對水平比較( ,n=10)Figure 4 Comparison of relative levels of LIGHT, HVEM,NF-κB and IL-6 protein in kidney tissues of rats in each group

3 討論

PE 腎損傷發生較早且較為嚴重,其病理生理變化為腎小球擴張、血管痙攣、腎血流量減少、腎小球濾過率下降,而出現蛋白尿,繼續惡化并累及腎小管,造成腎功能異常,從而引起母體內多種血清學指標改變[4]。 PE 機制復雜,動物模型是研究PE 發病機理與開發診治手段的主要工具,在大鼠飲水中加入L-NAME,雖不能使大鼠血壓升高,但可使大鼠在孕晚期出現蛋白尿和腎小球濾過率降低等PE 腎損傷現象[14]。 本研究通過腔注射L-NAME 后發現,與Normal 組相比,PE 組大鼠尿液中24 h 尿蛋白量、腎功能指標血清Scr、BUN 含量升高,腎組織出現腎小球內皮細胞彌慢性增生、腫脹、空泡樣變性,基底膜增厚,且有局灶節段性腎小球硬化及膜增生性腎小球腎炎病變。 提示PE 組孕鼠出現蛋白尿、腎功能損傷及腎病理變化,表明造模成功。

RSV 是我國傳統中藥虎杖中的主要活性成分,現代藥理學研究發現,白藜蘆醇可抑制腎炎癥反應等多種藥理作用,從而在腎病防治研究中倍受關注[10]。 He 等[15]研究發現,RSV 可通過調節單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)/還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)/活性氧簇(ROS)通路降低氧化應激反應,減少腎纖維化;Shao 等[16]發現RSV 可通過沉默信息調控因子1(Sirt1)/缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)信號途徑降低腎小球系膜細胞炎癥反應,減少腎損害。 然而RSV 對PE 過程中腎損傷的作用,卻未見報道。 本研究發現,與PE 組相比,RSV 低、高劑量組大鼠腎組織病理損傷明顯改善,尿液中24 h 尿蛋白量、腎功能指標血清 Scr、BUN 含量均減低,且RSV 高劑量組上述指標變化均優于RSV 低劑量組,表明RSV 腎損傷也具有改善作用,但具體分子機制還不甚明確,本研究對此進行繼續探究。

LIGHT 是 T 細胞活化共刺激分子,HVEM 是LIGHT 的配體之一,LIGHT 與 HVEM 結合后,可活化NF-κB 核轉錄因子或通過激活N 端激酶(JNK)/轉錄因子激活蛋白-1(AP-1)途徑誘導基因轉錄,并調控細胞生存、細胞因子表達及細胞增殖等生理活動[17-18]。近來研 究發現,LIGHT / HVEM 通路參與PE 病理過程及腎損傷過程,Wang 等[19]發現在PE 懷孕小鼠模型中LIGHT 顯著升高,向懷孕小鼠中注入重組LIGHT 會誘發小鼠PE 高血壓和蛋白尿形成,而抑制 LIGHT、HVEM 及 LTβR 表達可阻止PE 所致高血壓、蛋白尿、胎盤血管生成受損和內皮功能損傷等;Wang 等[20]在人類和小鼠試驗研究中發現,LIGHT 信號傳導激活可導致胎盤凋亡,血管活性因子分泌增加以及子癇前期母體蛋白尿升高;Wang 等[8]發現HVEM/LIGHT 通路參與腎移植排斥反應過程。 本研究發現,與Normal 組相比,PE 組大鼠腎組織中HVEM mRNA 及蛋白、LIGHT mRNA及蛋白均升高,NF-κB 及 IL-6 蛋白也明顯升高;與PE 組相比,RSV 低、高劑量組大鼠腎組織 HVEM mRNA 及蛋白、LIGHT mRNA 及蛋白、NF-κB 及 IL-6蛋白均依次降低,提示LIGHT/HVEM 通路可能參與PE 腎損傷過程,而 RSV 可抑制 LIGHT/HVEM 通路激活,減少炎癥因子釋放。 另外本研究用LTβR-Ig阻斷LIGHT/HVEM 通路,結果發現,與PE 組相比,LTβR-Ig 組大鼠腎組織 HVEM mRNA 及蛋白、LIGHT mRNA 及蛋白、NF-κB 及 IL-6 蛋白亦明顯降低,且大鼠尿液中24 h 尿蛋白量、血清 Scr、BUN 含量均減低,腎組織損傷明顯減輕,表明抑制HVEM/LIGHT 通路可緩解PE 腎損傷。 RSV 高劑量組各項指標與LTβR-Ig 組無明顯差異,推測 RSV 改善PE腎損傷的作用可能與抑制LIGHT/HVEM 通路有關。

綜上所述,RSV 可抑制PE 大鼠腎組織LIGHT/HVEM 通路,減輕PE 所致腎損傷,可能為闡明RSV改善 PE 腎損傷作用提供一定參考,但 LIGHT/HVEM 通路靶點較多,RSV 通過抑制LIGHT/HVEM通路激活改善PE 腎損傷機制也較為復雜,這需要后續繼續研究。