神曲消食口服液對功能性消化不良小鼠胃腸運動的影響及機制

張叢敏朱曉靜魏金鎧李紅亞李彩霞唐 卉靳晨晨趙永才

(保定市第一中心醫院兒科,河北保定 071000)

神曲消食口服液是一種純中藥制劑,是著名兒科專家方鶴松教授研制出的臨床驗方,對兒童脾胃功能虛弱和飲食積滯導致的厭食、食欲不振及食量減少等有獨特的藥效[1]。 小兒功能性消化不良(functional dyspepsia,FD)是臨床具有上腹痛、惡心、嘔吐及脹氣等癥狀,但排除器質性疾病的綜合征,其病情多反復、遷延,嚴重影響患兒身心健康[2]。目前,臨床治療常以經驗性治療為主,西藥治療后往往會出現口苦、咽干等不良反應,導致患兒依從性較差,影響治療效果[3]。 趙詠梅等[4]研究指出,神曲消食口服液對兒童功能性消化有較好的臨床效果,可明顯提高胃排空能力。 但神曲消食口服液制劑成分復雜,其安全性評價和具體作用機制的研究較少。 故本研究將觀察神曲消食口服液對正常KM 小鼠血常規及肝腎功能的影響,并構建FD 模型小鼠,探究神曲消食口服液對FD 小鼠胃腸運動能力的影響,并初步分析其作用機制,旨在為神曲消食口服液的臨床應用提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

95 只清潔級 KM 小鼠,雄性,6~8 周齡,28~32 g,購自河北省實驗動物中心[SCXK(冀)2019-0010],動物實驗于河北省實驗動物中心開展[SYXK(冀)2019-0001]。 飼養環境:21℃ ~25℃恒溫,相對濕度45% ~ 65%,晝夜明暗交替時間為12 h,各項操作符合動物實驗的“3R”原則,經保定市第一中心醫院醫學倫理委員會審核通過([2018]004 號)。

1.2 主要試劑與儀器

神曲消食口服液(揚子江藥業集團江蘇龍鳳堂中藥有限公司,國藥準字Z20153035,規格10 mL×6支,批號:201806);左旋精氨酸購自上海瑤韻生物科技有限公司,批號:180109;肝腎功能指標檢測試劑盒購自北京利德曼生化股份有限公司;引物合成由上海茁彩生物科技有限公司提供;蛋白一抗及二抗購自美國Abcam 公司。 血常規分析儀購自日本光電工業株式會社,型號為6318K;全自動生化分析儀購自美國貝克曼庫爾特公司,型號為 UniCal DxC800;熒光PCR 儀購自美國 Bio-Rad 公司,型號為CFX96。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組及給藥

40 只KM 小鼠隨機分為正常組、神曲消食口服液低、中及高劑量組,每組10 只,神曲消食口服液組分別灌胃0.1、0.2 及0.3 mL 神曲消食口服液(分別混以 0.2、0.1 及 0 mL 生理鹽水),每天 1 次,連續灌胃30 d,正常組以同體積生理鹽水替代。

1.3.2 血常規及肝腎功能檢測

取血后,經血常規分析儀和全自動生化分析儀檢測,血常規指標有:白細胞(white blood cells,WBC)、紅細胞(red blood cells,RBC)、血紅蛋白(hemoglobin,HGB)、血小板(platelet,PLT)、淋巴細胞 ( lymphocyte, LYM)、 單 核 細 胞 ( monocytes,MONO)及中性粒細胞(neutrophil,NEU),肝腎功能指標有: 天門冬氨酸氨基轉移酶( aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)、總膽汁酸(total bile acid,TBA)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)及肌酐(creatinine,CRE)。

1.3.3 模型建立及給藥

從55 只KM 小鼠中隨機選出10 只作為正常組,剩余小鼠采用不規律進食+左旋精氨酸(L-Arg)法構建FD 動物模型,具體方法[5]:以2 d 進食,1 d禁食為一個循環單位,循環10 d;第11 天和第12 天時腹腔注射0.1 g/kgL-Arg;正常組小鼠正常進食,腹腔注射以同體積生理鹽水替代。 造模結束后隨機選取5 只小鼠處死,檢測其胃排空率及小腸推進率降低,則判斷FD 模型復制成功,再將剩余40 只模型小鼠隨機分為模型組、神曲消食口服液低、中及高劑量組,每組10 只;神曲消食口服液組分別灌胃0.1、0.2 及0.3 mL 神曲消食口服液(分別混以0.2、0.1 及 0 mL 生理鹽水),每天 1 次,連續灌胃 14 d;正常組和模型組以同體積生理鹽水替代,觀察各組小鼠體重的變化。

1.3.4 胃排空及腸推進功能檢測

末次給藥后禁食24 h,每只0.5 g 的碳末半固體糊(5 g 羧甲基纖維素、8 g 奶粉、4 g 糖、4 g 淀粉及1 g 活性炭混于128 mL 水)灌胃;處死小鼠,取胃組織稱重,計為胃全重;剪開胃組織清除胃內容物后稱量,計為胃凈重;胃排空率=[1-(胃全重-胃凈重)/固體糊狀物重]×100%;取出完整小腸組織(胃部幽門切跡至碳糊最前端),測量其全長,小腸推進率=(胃部幽門切跡至碳糊最前端的距離/小腸全長)×100%。

1.3.5 HE 染色

將胃組織固定于4%多聚甲醛溶液中過夜,經常規HE 染色后,光學顯微鏡下觀察胃組織病理學改變,并拍照。

1.3.6 qRT-PCR 檢測

取適量小鼠胃組織,加入液氮研磨成粉末;加入適量RNAiso Plus,冰上靜置6 min,以12000 r/min離心6 min;以氯仿-異丙醇體系,提取總RNA;純度分析后,按照逆轉錄試劑盒說明書,合成cDNA 模板;加入SYBR Premix 進行 qRT-PCR 檢測,參數設置:95℃ 30 s,95℃ 5 s,60℃ 60 s,72℃ 1 min,共 39個 循 環。 GAPDH 上 游 引 物 5′-CGCTAACATCAAATGGGGTG-3′, 下 游 引 物 5 ′ -TTGCTGACAATCTTGAGGGAG-3′; 肌 醇 需 求 酶 1(Inositol requirement enzyme 1,IREl) 上游引物 5′-GGAGACCCTACGCTATTTGACCT-3′, 下 游 引 物 5′-TTGCTGACAATCTTGAGGGAG-3′;腫瘤壞死因子受體相關因子 2 ( Tumor necrosis factor receptorassociated factor 2, TRAF2 ) 上 游 引 物 5′-CGCGGATCCATGGCTGCAGCTAGCGTG-3′, 下 游 引物 5′-CGCTCTAGATTAGAGCCCTGTCAGGTCCTRA-3′[6]。 按照 2-△△CT法,以 GADPH 為內參,計算 IREl和TRAF2 mRNA 的相對表達量。

1.3.7 Western blot 檢測

取適量小鼠胃組織,加入液氮研磨成粉末;加入適量RIPA 裂解液,冰上勻漿40 min,以12000 r/min 離心 10 min,提取胃組織總蛋白;取 50 μg 上樣,進行恒壓電泳(80 V~110 V);再300 mA 恒流轉膜后,室溫下封閉1 h;4℃下蛋白一抗過夜,β-actin稀釋比為 1 ∶1000,IREl 稀釋比為 1 ∶500,TRAF2 稀釋比為1 ∶500;室溫下蛋白二抗孵育30 min,稀釋比為1 ∶10000;調整曝光條件,暗室中進行顯影、定影;掃描膠片,經Image J 軟件灰度分析后,以β-actin 為內參,計算胃組織中IREl 和TRAF2 蛋白的相對表達量。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0 軟件進行分析,數據以平均數±標準差()表示,多組均數比較采用單因素方差分析,組內兩兩比較采用LSD-t法,以P<0.05 表示組間差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血常規情況

各組小鼠血常規指標比較,組間差異無統計學意義(P>0.05),提示神曲消食口服液給藥對小鼠血常規各指標無影響,見表1。

表1 各組小鼠血常規指標的比較(n=10)Table 1 Comparison of blood routine indexes among all groups

2.2 肝腎功能情況

各組小鼠肝腎功能指標比較,組間差異無統計學意義(P>0.05),提示神曲消食口服液給藥對小鼠肝腎功能指標無影響,見表2。

表2 各組小鼠肝腎功能指標的比較(n=10,U/L)Table 2 Comparison of liver and kidney function indexes among all groups

2.3 一般情況及體重變化的比較

造模初期(1 周內),各組小鼠發育良好,活動度高。 造模1 周之后,模型組小鼠逐漸出現靠邊扎堆、活動度降低,毛發雜亂失去光澤,體重降低,但神曲消食口服液組小鼠上述表現較輕。 造模結束時,與正常組比較,其他組別小鼠體重增長更緩慢(P<0.05);干預結束時,與正常組比較,其他組別小鼠體重增長更緩慢(P<0.05),但與模型組比較,神曲消食口服液高劑量組體重增長加快(P<0.05),提示神曲消食口服液給藥可促進小鼠體重增長,提高其活動度,見表3。

表3 各組小鼠增長體重的比較(n=10,g)Table 3 Comparison of weight gain among all groups

2.4 胃組織病理學觀察

如圖1 各組小鼠胃組織粘膜層、粘膜下層、肌層及漿膜層結構清晰,均未見明顯的病理學改變,符合功能性消化不良動物模型的要求。

圖1 胃組織病理學觀察Note. A, Normal group. B, Model group. C, Low-dose Shenqu Xiaoshi oral liquid group. D, Medium-dose Shenqu Xiaoshi oral liquid group. E, High-dose Shenqu Xiaoshi oral liquid group.Figure 1 Pathological observation of gastric tissues

2.5 小鼠胃排空及腸推進功能

與正常組相比,模型組小鼠胃排空率和小腸推進率明顯降低(P<0.05);與模型組相比,神曲消食口服液低、中及高劑量組胃排空率和小腸推進率明顯升高(P<0.05),提示神曲消食口服液給藥可促進小鼠胃排空和小腸推進功能,見表4。

表4 各組小鼠胃排空及腸推進功能的比較(n=10,%)Table 4 Comparison of gastric emptying and intestinal propulsion function among all groups

2.6 胃組織IREl 和TRAF2 表達情況

與正常組相比,模型組IREl 和TRAF2 mRNA和蛋白的表達明顯上升(P<0.05);與模型組相比,神曲消食口服液低、中及高劑量組IREl 和TRAF2 mRNA 和蛋白的表達明顯下降(P<0.05),提示神曲消食口服液給藥可抑制小鼠IREl、TRAF2 mRNA 和蛋白的表達,從而改善內質網應激,見圖2、表5。

表5 各組小鼠胃組織IREl 和TRAF2 表達的比較(n=10)Table 5 Comparison on the expression of IRE1 and TRAF2 proteins in gastric tissues among all groups

圖2 各組小鼠胃組織IREl 和TRAF2 蛋白表達情況Note. A, Normal group. B, Model group. C, Low-dose Shenqu Xiaoshi oral liquid group. D, Medium-dose Shenqu Xiaoshi oral liquid group. E,High-dose Shenqu Xiaoshi oral liquid group.Figure 2 Expression of IRE1 and TRAF2 proteins in gastric tissues of each group

3 討論

中醫學中無“消化不良”的概念,結合臨床表現,可歸于“痞滿”的范疇,因其“脾常不足”的生理特點,多表現為脾胃虛弱證[7]。 而神曲消食口服液具有健胃消食、健脾理氣的功效,其主要藥物有焦山楂、焦神曲、焦麥芽、黨參、白術、茯苓、白芍、木香、醋延胡索、砂仁、甘草。 方中焦山楂、焦神曲、焦麥芽可消食導滯,黨參、白術、茯苓、白芍可健脾益氣,木香、醋延胡索、砂仁可健胃止痛,甘草則起調和諸藥之效[8]。 臨床研究結果顯示,神曲消食口服液具有提高機體細胞免疫功能的作用,可上調血清HGB[9]。 但本研究結果顯示,神曲消食口服液對RBC 及HGB 水平無明顯影響,可能原因有:(1)KM 小鼠體內環境與人體具有差異性;(2)作用時間較短。

肝是人體酶含量最豐富的器官,當肝受到損傷,組織細胞內酶類會進入外周血液中,導致血清中酶活性的異常升高,常用于肝功能檢查的指標主要有 ALT、AST 和 TBA 等[10]。 腎是重要的排泄器官,能調節機體內水電平衡、酸堿平衡。 BUN、CREA是臨床常見的腎功能檢測指標,在一定程度上可反映腎小球濾過功能[11]。 本研究結果顯示,神曲消食口服液對正常小鼠上述肝腎功能指標均無明顯影響,提示神曲消食口服液安全性較高。

本研究結果顯示,與正常組比較,模型組大鼠的胃排空率和小腸推進率明顯降低,說明建模后小鼠出現明顯胃腸動力障礙,且小鼠胃組織未出現明顯病理改變,但伴有體重降低、活躍度降低及情緒暴躁易怒,提示FD 造模成功。 經神曲消食口服液處理后,FD 小鼠體重增長加快,胃排空率和小腸推進率明顯升高,提示神曲消食口服液可明顯改善FD小鼠胃腸運動能力,與文獻報道相符[12]。 近年來研究發現,內質網應激在FD 中有重要的作用[13]。 機體產生內質網應激后,引起IREl 與GRP78 的分離,激活 IREl 的核酸內切酶活性,招募接頭分子TRAF2,引起細胞自噬或凋亡等其他變化,最終導致FD[14-15]。 本研究顯示,與正常組比較,模型組胃組織中IREl 和TRAF2 mRNA 和蛋白的表達明顯上調,說明FD 小鼠IREl 信號通路異常激活;但經神曲消食口服液處理后,IREl 和TRAF2 mRNA 和蛋白的表達明顯下調,提示神曲消食口服液可能通過抑制IREl 和TRAF2 表達,改善內質網應激,從而提高胃腸道細胞活力,最終起到治療FD 的作用。

綜上所述,神曲消食口服液具有較好的安全性,且對FD 小鼠的胃腸運動有明顯促進作用,可能與下調內質網因子IREl 和TRAF2 的表達,改善內質網應激有關。 同時在神曲消食口服液低、中、高劑量三組中,高劑量作用效果最強,提示中藥在用量上亦存在量效關系,但仍需要采用不同的建模方法,選用不同的動物載體,作進一步驗證。