小鼠肝癌原位移植性腫瘤動物模型的改良

羅曉琴丁冠茗鄭 旭金京燕劉 陽張 楠王靖宇王愛國

(大連醫科大學實驗動物中心,遼寧大連 116044)

在我國,原發性肝細胞癌是僅次于胃癌和肺癌的第三大惡性腫瘤,因其患病人數多、生存期短、病死率高,被稱為“癌中之王”,是我國醫療衛生事業的重要攻關課題[1]。 建立體內腫瘤動物模型是研究腫瘤發生、發展、浸潤、轉移及腫瘤治療的重要方法,在腫瘤的基礎和臨床前研究方面,以及加快抗腫瘤藥物的研發和促進腫瘤的轉化醫學研究等方面都具有重要的意義[2-3]。

肝的解剖位置和生理功能的特殊性決定了其不僅是人體最大的消化和代謝器官,也是重要的免疫器官。 由于肝直接接收來源于消化道的大量復雜營養物質,因而肝不僅要對病毒、細菌等有害抗原及時啟動免疫應答,同時還要免疫耐受絕大多數無害性抗原。 肝特殊的免疫耐受狀態被認為是肝癌發生發展的重要病因[4]。 因而,肝的特殊生理學特點決定了肝原位移植性動物模型是研究肝癌病理機制和探索治療方案的重要體內模型。 因此,建立肝原位移植性動物模型是肝癌的發病機制、侵襲、轉移,以及治療等研究的重要技術方法。

但在實際操作過程中,卻常因肝腫瘤細胞易從肝組織中溢漏,發生腹壁瘤、腹腔積液等情況,致使因肝內接種的肝腫瘤細胞數量不一致和實驗鼠體況差異增大,進而導致肝移植腫瘤大小不一、實驗結果的誤差波動范圍大和不確實等現象,無論是在動物福利方面,還是在動物實驗中人、財、物和時間的投入方面都是重要的損失[5]。 因此,摸索出一套穩定、高效、簡便易行的技術方法,是建立肝原位移植性腫瘤動物模型的實際需要。 本研究旨在建立一套高效、穩定的建立肝原位移植性腫瘤動物模型的技術方法,以茲同行參考和交流。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF 級 C57BL/6J 雄鼠 24 只,12 周齡,體重(23±2)g,購買于大連醫科大學重大疾病基因工程模式動物研究所[SCXK(遼)2018-0003]。 小鼠飼養于大連醫科大學實驗動物中心[SYXK(遼)2018-0007]。 實驗和飼養條件嚴格按照SPF 級實驗動物的規范要求。 飼喂的鼠糧為SPF 級小鼠AIN-93M標準飼料(脂肪占4%;碳水化合物占72.7%;蛋白質占12.5%),飲用水為滅菌的純凈水。 小鼠按照簡單隨機法分為兩組,每組12 只,分別為棉壓組和熱封組。 本實驗經過大連醫科大學實驗動物倫理委員會批準(AEE19065)。 實驗過程中嚴格遵守3R原則,且嚴格按照倫理要求控制移植腫瘤的長徑小于2 cm,體積小于2 cm3。

1.1.2 實驗細胞

小鼠肝癌細胞株H22 由大連醫科大學張宏穎教授贈予。

1.2 主要試劑與儀器

1640 培養基(Gibico);FBS(Gibico);1%青霉素和鏈霉素(碧云天公司);1.75%阿弗丁(2, 2, 2-Tribromoethanol,75-80-9,Sigma 公司);4%多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司);低生長因子Matrigel 基質膠(康寧公司)等。 二氧化碳培養箱(MCO-20AIC);超凈工作臺(ESCO,AC2-6S1);倒置顯微鏡(NOVEL,河南兄弟儀器設備有限公司);Vortex 振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

(1)一次性無菌醫用棉棒(江西松鶴醫療器械有限公司);1 mL 和10 mL 注射器(鎮江康利醫療器械有限公司);10 μL 微量注射針(上海高鴿工貿有限公司);微創手術剪;微創鑷子;止血鉗;寵物剃毛器;體視顯微鏡;針型電烙鐵(深圳市白光電子科技有限公司);縫合針;醫用真絲編織線(縫合線,規格4-0,黑色,產品標準號 YZB/滬0645-65-2005,上海浦東金環醫療用品有限公司)。

(2)自制手術輔助工具:直徑為0.5 cm 的墊背小木棒;撐開胸腔的帶線小金屬細彎鉤;長度為1 cm 的固定小棒(圖1)。

圖1 自制手術輔助工具Figure 1 Self-made auxiliary tools for surgery

1.3 實驗方法

1.3.1 H22 細胞的準備

將H22 細胞從液氮罐中取出,在37℃水浴鍋中晃動將細胞解凍,把細胞懸液移入含有7~8 mL 的37℃完全培養液的15 mL 離心管中,1000 r/min 離心5 min,棄上清,加入新的培養液,吹打混勻,移入培養瓶在CO2培養箱(37℃,5% CO2)中培養,連續培養3 代后,當細胞處于旺盛、穩定的生長狀態,可用于肝原位移植性實驗。 調整細胞濃度:每毫升1×108個,和 Matrigel 基質膠按照 4 ∶1混合均勻,置于冰上等待后續注射實驗,使用前Vortex 振蕩混勻。

1.3.2 肝原位移植性腫瘤動物模型的制備

(1)小鼠在手術前提前禁水糧4 h,小鼠稱重,按0.25 mL/10 g 體重腹腔注射麻醉藥阿弗丁,麻醉后使用寵物剃毛刀剃去腹部手術部位的毛,將小鼠固定于泡沫板制成的手術臺上(圖2)。

(2)剃毛并依次使用碘伏和75%乙醇對腹部備皮部位進行消毒,用眼科剪沿腹部正中線從劍突向下做一約1.5~2.0 cm 的縱向切口,暴露劍突(圖2)。

(3)用帶線小金屬細彎鉤將切口兩側皮層與肌層一同分別拉向切口兩側,固定拉鉤。 將一個直徑為2 cm 的小棒墊于小鼠背部肝上緣以便充分暴露肝,觀察小鼠肝的解剖結構是否正常,手指輕壓兩側肋弓以擠出部分肝左葉(圖2)。

圖2 手術小鼠固定方法Figure 2 Fixation method of surgical mice

(4)調整立體顯微鏡的焦距,使肝左葉清晰地暴露在顯微視眼下,使用Vortex 將細胞振蕩混勻后,使用規格為10 μL 的微量注射針緩慢吸取5 μL細胞液。 微量注射針的針頭與肝表面呈20 度角進針,進針后使針頭與桌面平行,平行推進約1 cm(針尖的最終位置不宜太過靠近肝葉邊緣薄處),緩慢注入5 μL H22 細胞懸液,可觀察到注射區域大部肝葉顏色迅速變淺(白斑)或出現渾濁的半透明空泡。

(5)注射后針體停留1 min,再緩慢退出白斑或空泡區域,退出該區域后等待2~4 min,退出全針。為防止腫瘤細胞從針孔溢漏,我們依據采用的應對方法的不同,分為棉壓組和熱封組。 棉壓組小鼠在退針后迅速使用無菌棉簽壓迫進針口,直至無出血情況后移走棉簽。 熱封組小鼠在退針后使用無菌棉簽迅速壓迫進針口的同時,使用針型電烙鐵輕輕灼燒封閉針孔。

(6)用蘸取75%乙醇的棉棒輕輕擦拭肝葉表面后,將肝左葉輕緩地移回腹腔。

(7)根據稱量的小鼠體重值,向腹腔注射濃度為 8 μg/μL 的慶大霉素(5 mL/kg),使用 4-0 非吸收性縫合線依次縫合腹膜和皮膚。

(8)縫合完畢后,使用75%乙醇擦拭縫合的切口及周圍的皮膚,將小鼠放置于35℃加熱墊上待其復蘇。 完全復蘇后,移入飼養盒內進行常規飼養。

1.3.3 術后觀察及檢測

(1)日常觀察:小鼠術后的生活狀態,進食、飲水、活躍健康狀況,異常死亡情況等。

(2)樣本取材:第19 天處死小鼠,解剖取出肝稱重拍照,分離腫瘤組織稱重并拍照,同時使用游標卡尺測量每只小鼠腫瘤的長徑(a)和短徑(b),按公式:V=ab2/2 計算腫瘤體積。

(3)病理學檢測:腫瘤組織標本用4%多聚甲醛固定后做病理學檢測,常規取材、脫水、石蠟包埋、制片(4 μm),HE 染色,光學顯微鏡下觀察。

1.4 統計學方法

肝重數據采用t檢驗進行統計學分析。 兩組比例差異應用卡方檢驗進行統計學分析。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 模型鼠的存活狀態

在術中均未見死亡,并于術后2~3 h 后蘇醒。模型鼠術后存活狀況良好,1 d 后活動正常,5 d 后手術刀口恢復。 在5~18 d 的飼養過程中,棉壓組和熱封組小鼠的存活率均為91.7%,各有1 只小鼠在后期的飼養過程中死亡,剖檢時發現死亡小鼠的結腸內有大量內容物聚集,結腸腫脹,可能是由于麻醉時針刺損傷、麻醉藥作用、術中機械牽拉刺激或腫瘤壓迫等因素導致排便功能異常或麻痹性腸梗阻所致,食物殘渣不能正常排出,導致代謝功能紊亂而最終死亡。

2.2 模型鼠肝腫瘤成瘤情況

接種后第19 天對模型鼠進行剖檢,觀察肝移植瘤的成瘤情況。 肝內肉眼可見明顯的移植瘤,瘤形狀相對規則,呈白色的橢圓或者長條形(圖3、圖4)。 結果表明,移植瘤小鼠的成瘤率為100%。

圖3 移植瘤實體表觀Figure 3 A representative physical photograph of transplanted liver tumor

腫瘤測量結果顯示,棉壓組小鼠的腫瘤最大長徑為1.83 cm,平均體積為(0.27 ± 0.16)cm3,平均重量為(0.19 ± 0.07)g;熱封組小鼠的腫瘤最大長徑為1.75 cm,平均體積為(0.34 ± 0.09)cm3,平均重量為(0.18 ± 0.02)g。 兩組小鼠的腫瘤大小和腫瘤重量雖無統計學差異,但與棉壓組相比較,熱封組的肝移植瘤的大小均一,腫瘤重量的波動性小(圖4)。 另外,在剖檢時發現,棉壓組出現了高比率的腹水(36.4%)和腹壁瘤(36.4%)(圖5),而熱封組沒有出現上述現象,兩組統計學差異顯著(表1)。說明棉壓組的腫瘤細胞從注射孔溢漏的情況顯著增高,這也是棉壓組肝移植瘤大小波動性較大的根本原因。 另外,在棉壓組還發現1 只發生腹水的小鼠出現肝內多個腫瘤結節(圖6),這可能是腹水瘤細胞通過脈管系統形成的肝轉移現象。

圖6 腫瘤細胞的肝內轉移Figure 6 Intrahepatic metastasis of tumor cells

表1 棉壓組和熱封組小鼠生存和腫瘤情況的比較Table 1 Comparison of survival and tumor status of mice between cotton-pressed group andheat-sealed group

圖4 移植瘤大小及重量的波動范圍Note. A, Physical photographs of transplanted tumors. B, Fluctuation range of transplanted tumor volume. C,Fluctuation range of transplanted tumor weight.Figure 4 Fluctuation ranges of size and weight of the transplanted tumors

圖5 棉壓組出現的腹水和腹壁瘤Note. A, Ascites in the cotton-pressed group. B, Abdominal wall tumor in the cotton-pressed group.Figure 5 Ascites and abdominal tumor appeared in the cotton-pressed group

2.3 病理學檢測

病理學檢測結果表明(圖7),雖然棉壓組與熱封組在腫瘤大小的波動性上有明顯的不同,但在病理學表型上沒有顯著差異。 HE 染色光鏡下觀察,癌細胞排列緊密,表面不規則,異型性明顯,分化程度差,核深染,呈現分葉及多核現象,游離核糖體增多,腫瘤邊緣浸潤肝組織。

圖7 肝原位移植性腫瘤的病理學檢測Figure 7 Pathological examination of orthotopic liver transplanted tumors

3 討論

動物模型應該盡可能地接近人類腫瘤的自然生物學過程。 腫瘤模型主要包括自發性、移植性、化學性誘發性和轉基因腫瘤模型,這些腫瘤動物模型已經被廣泛地應用于腫瘤發生和發展分子機制的研究中[6-8]。 因自發性和轉基因腫瘤模型具有遺傳性特征,局限于特定的遺傳特質或人為遺傳修飾的動物模型,應用范圍有限。 由于移植性和化學性誘發性腫瘤動物模型的建立具有易于獲取實驗動物和相對技術難度小等特點,是目前實驗室普遍應用的腫瘤動物模型。 雖然誘發性腫瘤動物模型與自然腫瘤發生過程相近,但具有實驗周期長、個體差異大、致死性高、實驗動物用量大等缺點[9]。 而移植性腫瘤動物模型因其具有實驗周期短、個體差異小、致死性低、實驗動物用量少等優點,已成為實驗室最常用的腫瘤動物模型[10]。

移植性腫瘤動物模型主要分為皮下移植性和原位移植性兩種[11]。 與原位腫瘤移植模型相比,雖然皮下腫瘤移植模型操作簡單、技術難度小、成功率高、易于觀測和局部干預,但存在因血液供應不足而發生后期的皮膚破潰和中心組織壞死;因被膜相對完整而局限于皮下,缺乏周圍組織浸潤及遠處淋巴結轉移,不能很好地模擬腫瘤浸潤和轉移的病理生理學過程等缺點[12-13]。 特別是忽略了腫瘤與周圍正常組織的相互作用關系,在組織細胞的生物學環境、免疫環境、腫瘤形成、病理生理學變化等方面仍存在較大的差異,不能很好地模擬腫瘤的自然生物學過程,有一定的局限性[14-16]。 原位移植性腫瘤模型可有效克服皮下移植瘤的缺點,是目前腫瘤研究中較為理想的基礎體內動物模型。

由于野生型小鼠具有完全的免疫能力,因而應用H22 等鼠源性肝癌細胞制備野生型小鼠的肝原位移植性肝癌動物模型是實驗室常用的研究方案[17-18]。 但H22 肝癌細胞屬于種植腹水型肝癌細胞,具有擴增速度快,容易擴散的特點。 在制作肝原位移植性腫瘤動物模型過程中,除了因為無法很好地解決肝腫瘤細胞濃度、注射體積、壓迫肝止血和防止腫瘤細胞溢漏等問題,從而導致肝原位移植瘤大小不均一的現象,還常出現腹水和腹壁瘤等附加異位接種等情況,極大地影響了最終實驗結果的統計和判定[19]。 有些學者為了避免上述現象,采用先建立皮下移植腫瘤,然后取出皮下移植的腫瘤組織將其切成小塊(2 mm × 2 mm × 1 mm 左右),再采取肝內隧道植入法移植到肝內。 但這個方法操作難度大,容易造成動物肝大量出血并引起動物死亡,同時手術時間較長,具有較大的操作難度,在人員有限的情況下不適用于制備大批量的肝原位移植性腫瘤動物模型,影響荷瘤成功率[20]。

為解決上述難點,本研究通過對實驗方法和細節的不斷摸索和多次改進,建立了一種簡易、有效、穩定、可行性高的原位移植性肝癌的方法,總結經驗要點如下:

(1)保持高細胞活性。 體外培養H22 懸浮細胞可保證細胞的高純度和高活性。

(2)手術視野要寬闊。 腹部切口適度(1.5~2 cm),同時用自制器材拉開腹皮,以便充分暴露肝,便于操作。

(3)選擇微量注射器。 使用細的微量注射針將細胞緩緩注入小鼠肝,可減輕針頭對肝的損傷,減少針口面積,提高實驗成功率。

(4)嚴格控制注射體積。 為避免注入肝的細胞混懸液因壓力過大而發生溢漏,形成腹壁瘤或腹腔積液的現象,可使用10 μL 微量注射針向肝注射5 μL 細胞懸液,盡可能減少注射體積。

(5) 應用 Matrigel 基質膠。 將細胞懸液和Matrigel 基質膠混勻,可避免在原位接種細胞懸液的彌散,有效地形成實體瘤。

(6)注意進針的角度和深度。 C57BL/6J 小鼠肝較薄,進針角度過大極易穿透肝,從而引起腹腔種植,導致接種的失敗。 在實驗過程中需將針尖與肝表面呈20 度進針,針尖行程約為1.0 cm,可有效保證所注射的細胞位于肝左外側葉實質內。

(7)選擇合適大小的小鼠。 在小鼠的選取上,盡量使用自然生長環境下的雄性 C57BL/6J 小鼠,出生在 12~15 周,體重在(23 ± 2)g 為宜,避免肝葉太小影響細胞注射過程增大手術難度,也可避免性激素可能對肝移植瘤生長的影響。

(8)清除殘余腫瘤細胞。 使用針型電烙鐵灼燒針孔后,要用酒精棉球輕擦針孔周圍及肝表面,防止少量遺漏的腫瘤細胞異位種植于腹壁或腹腔內。

(9)術前禁水禁糧。 在進行手術前4 h 對小鼠禁水禁糧,避免麻醉時的不良反應。

(10)謹慎柔和操作。 在手術操作的過程中要輕柔、謹慎,避免損傷其他臟器。

(11)縫合打結后線頭要留0.3 cm 左右。 小鼠腹皮縫合時,縫合打結后,線頭要留的長一些,避免小鼠蘇醒后在活動或啃咬中解開,導致胃腸和肝暴露而死亡。

本研究探索出制備均一、穩定肝原位移植性腫瘤動物模型的技術方法并總結其實施要點,具有時間短,易操作,模型穩定性高等特點,以茲與肝癌研究的同仁進行交流和相互借鑒。