葛根素減輕輻射誘發的大鼠急性腸黏膜損傷的實驗研究

左振魁韓佳瑞*計樹靈賀璐璐段曉宇范 颯祝康杰

(1.河南省中醫院(河南中醫藥大學第二附屬醫院)肛腸科,鄭州 450000;2.河南中醫藥大學,鄭州 450000)

放療是惡性腫瘤治療的最重要的策略之一,大約有一半的癌癥患者接受放療[1]。 盡管放療對惡性腫瘤有確切的療效,但放療也會引起正常組織的毒性反應,這其中就包含了胃腸道消化系統、造血系統和腦血管系統的急性放射綜合癥[2-3]。 高劑量(≥9 Gy)的全身輻射會觸發急性胃腸道毒性,甚至可能會導致患者的死亡[4-5]。 據報道[6-7],輻射可以引起正常細胞氧化應激損傷和炎癥反應,并甚至導致正常細胞壞死。 腸道對放射線高度敏感,因此放射線導致的腸道上皮和內皮損傷在急性放射反應的發展中起重要作用[8]。

葛根素(puerarin,Pue)是從葛根的根莖中提取的具有藥理活性的化合物[9]。 Pue 具有包括緩解胰島素抵抗、抗氧化應激、抗炎、抗心肌損傷等廣泛的生物活性,并已被當作替代藥物來治療各種代謝性、炎癥性和心血管疾病[10-12]。 先前已有報道[13],Pue 對大鼠的電離輻射損傷具有保護作用,其保護機制可能與其抗氧化性有關。 然而,Pue 在輻射誘發的腸道損傷的具體作用機理仍不清楚。 因此,本研究的目的是對Pue 在保護大鼠免于輻射誘發的腸道損傷中的作用以及潛在的分子機制進行進一步的評估。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

24 只 7 周齡 SPF 級雄性 SD 大鼠(190~210)g購自河南省實驗動物中心[SCXK(豫)2017-0001],將大鼠飼養在溫度(20℃~25℃)和濕度(50% ~65%)的河南省中醫院SPF 級動物房[SYXK(豫)2016-0008]的飼養籠中,每天進行明暗12 h/12 h循環,可自由獲得食物和水。 所有動物實驗步驟均經過河南省中醫院動物倫理委員會批準(2016060101),并符合實驗大鼠的3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

葛根素注射液(浙江康恩貝制藥股份有限公司生產)購自本院門診藥房;血小板內皮細胞粘附分子1(platelet endothelial cell adhesion molecule 1,PECAM1)抗體(sc-1506)和 β 微管蛋白(β-tubulin)抗體(sc-8035)購于美國Santa Cruz Biotechnology公 司; 抗 原 Ki-67 ( Ki-67 antigen, Ki67) 抗 體(DRM004)購于美國Acris Antibodies 公司;閉合蛋白-1(Claudin-1)抗體(ab15098)購于美國Abcam 公司;閉鎖小帶蛋白-1(zonula occludens protein-1,ZO-1)抗體(21773-1)購于美國Proteinteck 集團公司武漢三鷹生物技術分公司;丙二醛(malonyldialdehyde,MDA)檢測試劑盒(S0131) 和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性試劑盒(S0103)購自上海碧云天生物科技有限公司。 Clinac 2100C/D型線性加速器(Varian 公司,美國);Eclipse 80i 型熒光顯微鏡(Nikon 公司,日本);I170-4500 型垂直電泳電轉儀(Bio-Rad 公司,美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組與處理

適應性飼養3 d 后,將大鼠隨機分為對照組(control,Con)、單純輻射組(radiation,RT)和輻射+葛根素組(RT+Pue),每組8 只大鼠。 通過單劑量12 Gy 下腹部照射構建輻射誘發的大鼠腸損傷模型,步驟簡述如下:將大鼠固定在手術板上(不使用麻醉劑),用遮板(鉆一個直徑3 cm 圓孔,用于暴露大鼠下腹部)覆蓋大鼠,并利用Clinac 2100C/D 型線性加速器(6 MV X 射線,劑量率4 Gy/min,源距100 cm)單劑量12 Gy 照照放射大鼠下腹部。 對照組大鼠使用遮板完全覆蓋身體,單純輻射組和輻射+葛根素組大鼠采用上述照射方式進行輻射。 輻射結束后,輻射+葛根素組大鼠采用尾靜脈注射15 mg/(kg·d)(臨床實踐中人用藥劑量通過體表轉換所得)葛根素,連續給藥7 d;對照組和單純輻射組大鼠采用相同方式在相同時間段通過尾靜脈注射等體積的生理鹽水。

1.3.2 樣品采集

第8 天,麻醉大鼠后,斷頭處死,收集大鼠小腸的空腸段。 根據實驗設計,空腸組織被分為兩個部分。 一部分空腸組織固定在10%的中性緩沖多聚甲醛中,制作石蠟包埋組織,被制備4 μm 厚的空腸組織切片,以用于后續組織學和免疫組化檢測;另一部分空腸組織直接凍存在-70℃,以用于后續免疫印跡分析。

1.3.3 病理形態學觀察

取空腸石蠟切片,經脫蠟、再水化后,行常規蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色。 每只大鼠任取4 個不同的空腸切片在Eclipse 80i 顯微鏡白光視野下觀察,并采用隨機視野拍照。 通過Image J 軟件計數空腸橫斷面中的隱窩計數和杯狀細胞密度數并測量腸絨毛長度。

1.3.4 免疫組化染色

每只大鼠任取4 個不同的空腸切片,經脫蠟、再水化、3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶和封閉非特異性蛋白后,室溫孵育一抗(PECAM1,1 ∶100 稀釋;Ki67,1 ∶200 稀釋)2 h,甩干并用 PBS 洗 5 min × 5次,室溫孵育二抗30 min,甩干并用PBS 洗5 min ×5 次,DAB 顯色5 min,蘇木精復染15 s,0.1% HCl分化、藍化、脫水干燥和透明后,Eclipse 80i 顯微鏡白光視野下觀察,并采用隨機視野拍照,用Image J軟件統計陽性信號值。

1.3.5 免疫印跡分析

通過蛋白印跡法檢測緊密連接(tight junction,TJ)蛋白 claudin-1 和ZO-1 的表達。 取空腸組織并用RIPA 裂解液在4℃下勻漿。 勻漿液在4℃下以1.4×105r/min 離心 15 min 后,收集總蛋白。 蛋白定量后,取25 mg 蛋白在10% SDS 聚丙烯酰胺凝膠行電泳分離,并電轉移到PVDF 膜上。 用5%脫脂奶粉封閉膜后,將膜與一抗(Claudin-1,1 ∶1000 稀釋;ZO-1,1 ∶2000 稀釋;β-tubulin,1 ∶5000 稀釋)在室溫下孵育 2 h,洗滌后,將膜用 HRP 偶聯的二抗(1 ∶4000 稀釋)在室溫下孵育1.5 h,洗滌后,用化學發光法對蛋白條帶顯影。 用Image J 軟件對條帶進行光密度值測定,并將目標蛋白的光密度值相對于β-tubulin光密度值進行標準化。

1.3.6 SOD 活性和MDA 水平測定

取空腸組織并用RIPA 裂解液在4℃下勻漿。取勻漿液進行蛋白定量后,按照試劑盒說明書步驟,進行測量組織中的SOD 活性和MDA 水平。 反應結束后,用酶標儀測量波長450 nm(SOD)和530 nm(MDA)處的吸光度值,并根據預制的標準曲線計算單位重量(mg)蛋白含量的SOD 活性和MDA 水平,表示為 U/mg 蛋白(SOD) 和 nmol/mg 蛋白(MDA)。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 葛根素對輻射下的空腸病理形態學改變的影響

如圖1 所示,對照組絨毛排列整齊且較長(圖1A、1J),在絨毛底部有大量隱窩(圖1D、1K)且隱窩內杯狀細胞數正常(圖1D、1L)和基底層正常(圖1G);與對照組比較,單純輻射組絨毛排列紊亂且長度明顯縮短(P<0.001)(圖1B、1J)、隱窩數明顯減少(P<0.01)(圖1E、1K)且隱窩內杯狀細胞數明顯增加(P<0.001)(圖 1E、1L)和基底層增厚(圖1H);與單純輻射組比較,輻射+葛根素組絨毛排列趨向整齊且長度明顯增加(P<0.01)(圖1C、1J)、隱窩數明顯增加(P<0.01)(圖1F、1K)且隱窩內杯狀細胞數明顯減少(P<0.01)(圖1F、1L)和基底層變薄(圖1I)。

圖1 葛根素改善輻射造成的空腸病理學改變Note. A-I, Representative HE staining images in various groups. J-L, Statistical results of villus length (J), crypt count (K) and goblet cell count in crypt (L). n= 8. Compared with control (Con) group,##P<0.01,###P<0.001. Compared with radiation (RT) alone group,**P<0.01.Figure 1 Puerarin improves the pathological changes of jejunum caused by radiation

2.2 葛根素對輻射下空腸中Ki-67 分布與表達的影響

如圖2A 顯示,對照組大多數隱窩中觀察到弱的K-i67 染色;單純輻射組僅有少部分隱窩顯示少量K-i67 陽性染色;輻射+葛根素組顯示大量隱窩中有較強的Ki-67 染色。 與對照組比較,單純輻射組空腸中Ki-67 表達明顯降低(P<0.001);與單純輻射組比較,輻射+葛根素組空腸中Ki-67 表達明顯增加(P<0.001),見圖2B。

圖2 葛根素促進輻射下空腸組織中Ki-67 表達并改善其分布Note. A, Representative immunohistochemical staining images of Ki-67 in various groups. B, Relative gray values of Ki-67 expression. n= 8. Compared with control (Con) group, ###P<0.001. Compared with radiation (RT) alone group,***P<0.001.Figure 2 Puerarin promotes the expression and improves the distribution of Ki67 in jejunum tissues under radiation

2.3 葛根素對輻射下空腸絨毛中PECAM1 分布與表達的影響

如圖3A 顯示,對照組顯示絨毛上皮細胞的表面結構正常,顯示單個柱狀完整上皮(即:PECAM1只在上皮細胞中大量表達);單純輻射組顯示絨毛上皮結構破壞、上皮細胞大量丟失,且上皮細胞滲入固有層(即:上皮細胞標記物PECAM1 在固有層表達);輻射+葛根素組顯示絨毛上皮結構趨向正常,上皮細胞數增多,滲入固有層中的上皮細胞數降低(即:固有層中PECAM1 陽性細胞數減少)。 與對照組比較,單純輻射組空腸中PECAM1 表達明顯降低(P<0.001);與單純輻射組比較,輻射+葛根素組空腸中PECAM1 表達明顯增加(P<0.001),見圖3B。

圖3 葛根素改善輻射誘發的空腸絨毛上皮結構紊亂Note. A, Representative immunohistochemical staining images of PECAM1 in various groups. B, Relative gray values of PECAM1 expression. n = 8. Compared with control (Con) group,###P<0.001. Compared with radiation (RT) alone group,***P<0.001.Figure 3 Puerarin improves the structure disorder of villous epithelium in jejunum induced by radiation

2.4 葛根素對輻射所致腸粘膜損傷的影響

蛋白免疫印跡結果顯示,與對照組比較,單純輻射組空腸中Claudin-1(圖4A、4B)和ZO-1(圖4A、4C)蛋白表達均明顯降低(P<0.001);與單純輻射組比較,輻射+葛根素組空腸中 Claudin-1(圖4A、4B)和 ZO-1(圖4A、4C)蛋白表達明顯增加(P<0.001)。 進一步檢查了葛根素對輻射所致腸組織氧化應激水平的影響,結果顯示,與對照組比較,單純輻射組空腸中SOD 活性明顯降低(圖4D)(P<0.001)和MDA 水平明顯升高(圖4E)(P<0.001);與單純輻射組比較,輻射+葛根素組空腸中SOD 活性明顯升高(圖4D)(P<0.001)和MDA 水平明顯降低(圖4E)(P<0.01)。

圖4 葛根素改善輻射所致腸粘膜損傷Note. A, Western blot band images of the expression of Claudin-1 and ZO-1 proteins in various groups. B, Relative expression level of Claudin-1 protein. C, The relative expression level of ZO-1 protein. D,SOD activity. E,MDA level. n=8. Compared with control(Con) group,###P<0.001. Compared with radiation (RT) alone group,**P<0.01,***P<0.001.Figure 4 Puerarin improves intestinal mucosal damage caused by radiation

3 討論

盡管放療能使腫瘤患者獲益,但放療造成的正常組織損傷也不可忽視,并且,放療損傷也是制約腫瘤放療效果的主要問題之一[14]。 腸道對輻射高度敏感,胸、腹部和全身放療均有可能引起腸道放療綜合癥的發生[2-3]。 因此,緩解放療造成的腸道粘膜損傷,不僅能減少放療的腸道副作用,還可能增加腫瘤患者序貫放療的治療效果。 雖然,目前臨床針對防治放療造成的腸道損傷的藥物頗多,但總體效果并不令人滿意[15]。 因此,目前急需開發針對輻射后腸損傷新的有效的藥物。

天然中草藥提取物因效果顯著且毒副作用低,引起了眾多研究者的注意。 葛根素是從葛根的根莖中提取的具有藥理活性的化合物[9],因其具有安全有效性而被臨床廣泛用作代謝性、炎癥性和心血管疾病的替代藥物[10-12]。 且先前的研究[13]表明,葛根素對實驗大鼠的全身電離輻射損傷具有保護作用,但具體機制并不清晰且研究指標偏少,很多作用并不明確。 另外大量研究[16-17]提示,葛根素還具有潛在的抗腫瘤效應。 因此,推測葛根素可能是潛在的抗輻射損傷的優良防護劑。 因此,本研究進一步細致的觀察葛根素對輻射造成的腸道損傷的影響并分析了其潛在的機制。 本研究結果顯示,葛根素能增加輻射條件下的空腸組織的絨毛長度和隱窩數,并減少了隱窩中杯狀細胞的密度。 為進一步解釋葛根素能減少輻射造成空腸隱窩丟失的原因,本研究用免疫組化檢測了空腸中增殖標志物Ki-67 的表達和分布。 由于腸干細胞和增殖性隱窩細胞位于隱窩[18]中,因此本研究通過隱窩中Ki-67 的表達來評估腸受損后的再填充活性,結果顯示,葛根素治療后,大量隱窩中有較強的Ki-67 表達,提示葛根素能促進輻射損傷的空腸的隱窩細胞再生。另外,本研究還利用PECAM1 標記內皮細胞觀察了葛根素對輻射造成空腸絨毛上皮結構紊亂的影響,結果發現,葛根素能維持輻射條件下絨毛上皮結構,降低絨毛上皮損傷并減少絨毛上皮細胞丟失。以上結果充分顯示了,葛根素能改善輻射造成的腸粘膜病理形態改變,保護絨毛外在和內在結構完整性和減少輻射造成的隱窩丟失并促進隱窩再生,促進損傷后黏膜恢復。

TJ 蛋白是細胞旁通透性的主要決定因素,它反映了組織中TJ 的完整性[18]。 腸損傷會導致腸內TJ蛋白的表達和分布發生變化,這也被稱為功能性TJ(屏障功能)缺陷,且屏障完整性的喪失的最主要的特征正是TJ 的蛋白分解[18-21]。 有研究發現,X 射線誘發的大鼠回腸損傷后腸屏障功能減退主要體現在輻射導致 TJ(Claudin-1 和 ZO-1)的破壞[19]。本研究結果也體現了輻射后造成空腸Claudin-1 和ZO-1 表達降低,提示輻射造成腸屏障功能減退,使得腸道黏膜通透性增加;而葛根素能顯著恢復輻射誘導的Claudin-1 和ZO-1 蛋白表達的降低,這進一步證實了葛根素對輻射誘導的腸損傷的保護作用。氧自由基的破壞是輻射引起的組織損傷的重要機制,MDA 水平和SOD 活性是組織過氧化程度的重要指標[22]。 本研究發現大鼠腹部輻射后,空腸組織MDA 水平升高,而SOD 活性顯著下降,提示輻射造成腸道過氧化應激損傷;而葛根素治療能增加空腸組織SOD 活性,并降低MDA 水平,提示葛根素能降低輻射造成腸道氧化應激損傷。 因此,葛根素減少氧化的作用可能在抑制輻射誘發的腸損傷和改善生存優勢方面起重要作用。

這項研究表明葛根素可以通過促進TJ 蛋白(Claudin-1 和ZO-1)表達而維持腸道屏障完整性、減少氧化應激損傷、促進隱窩細胞再生和維持腸絨毛上皮結構完整性的作用來保護大鼠免受輻射誘發的腸道損傷。 因此,葛根素可能是預防輻射誘發的腸道損傷的有希望的候選藥物。