環磷酰胺腹腔注射誘導建立大鼠間質性膀胱炎模型的優化

陳 彪董熙遠

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院婦產科,武漢 430030)

間質性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征(interstitial cystitis/Bladder Pain Syndrome, IC/BPS)是一種病因尚不明確的可導致病人嚴重精神衰弱的臨床綜合征, 主要表現為膀胱功能紊亂及下腹疼痛,嚴重影響患者生活質量[1-2]。 雖有多種理論假說試圖解釋IC/BPS 的發病原因,然而其機制仍不明確,基于動物模型的科學研究成為探索IC/BPS 等泌尿系統疾病發病機制及治療方法的重要途徑[3]。

目前,環磷酰胺(cyclophosphamide, CYP)腹腔注射誘導建立的大鼠間質性膀胱炎模型是IC/BPS的科學研究中使用最多的實驗動物模型之一[4]。在前期工作中,我們發現文獻報道中多種劑量的環磷酰胺被用于腹腔注射建立大鼠IC/BPS 模型開展IC/BPS 研究,如毛厚平等[5]用 75 mg/kg CYP 腹腔注射建立大鼠IC/BPS 模型探索透明質酸治療IC/BPS 的機制,而 Smaldone 等[6]采用 150 mg CYP 腹腔注射建立大鼠IC/BPS 模型探索IC/BPS 的尿液生物標志物。 此外,不同劑量的環磷酰胺可不同程度的改變膀胱感覺和功能,即使相同劑量的環磷酰胺在不同的研究中對膀胱功能的影響也并不一致[7]。 Juszczak 等[8]用 200 mg CYP 單次腹腔注射建立模型發現CYP 引起顯著的膀胱炎性改變并增加排尿期膀胱最大收縮力;而 Büyüknacar 等[9]采用150 mg CYP 腹腔注射卻發現大鼠排尿期膀胱收縮幅度并未改變。 可靠和一致的動物模型是開展病理生理研究和整合不同研究成果的前提,因此,開展系統性的研究以明確環磷酰胺用量及評估其建模效率顯得非常重要和迫切。

臨床上,膀胱疼痛和功能紊亂是IC/BPS 患者的主要癥狀,部分患者伴有明顯的軀體痛覺過敏。近年來越來越多的證據支持炎癥在IC/BPS 病理生理過程中發揮核心作用,多種炎癥因子被證實在IC/BPS 患者膀胱組織中表達增高[10-11]。 前期研究發現150 mg/kg CYP 腹腔注射建立的IC/BPS 模型大鼠尿液和膀胱組織中的 IL-1β 表達顯著升高[12-13]。 本課題基于環磷酰胺單次腹腔注射的方法,將Sprague-Dawley (SD)大鼠隨機分組后腹腔注射不同劑量的環磷酰胺,比較各組大鼠膀胱功能、疼痛感知和膀胱組織炎癥狀態及IL-1β 表達情況,探索環磷酰胺劑量和建模效率的最佳契合點,以期建立規范的環磷酰胺腹腔注射建立大鼠IC/BPS 模型的方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康清潔級雌性成年SD 大鼠70 只,每只體重200~220 g,購自湖北省實驗動物中心[SCXK(鄂)2017-0012]。 大鼠在華中科技大學實驗動物中心適應性飼養一周后進行實驗[SYXK(鄂)2016-0057]。 本課題得到華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院實驗動物倫理委員會批準(20170828037),符合3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

環磷酰胺(純度 98.9%, PHR1404,Sigma-Aldrich );烏拉坦(純度 99.8%, U2500,Sigma-Aldrich);Von-Frey 纖毛(Aesthesio, Danmic);電子天平(Mettler Toledo); 生理記錄儀(PowerLab 26T,AD Instruments);逆轉錄試劑盒(Thermo Fisher);熒光定量試劑盒(DBI Bioscience);熒光定量PCR 儀(LightCycler?96, Roche)。

1.3 實驗方法

1.3.1 建模方法

將環磷酰胺溶于生理鹽水配置成質量分數30 mg/mL 溶液,大鼠采用隨機數字表法隨機分成七組,每組10 只。 對照組大鼠腹腔注射1 mL/100 g體重生理鹽水,其余六組按50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg、200 mg/kg、250 mg/kg 或 300 mg/kg 分別取上述環磷酰胺溶液用生理鹽水稀釋并按1 mL/100 g 體重腹腔注射建立模型。

1.3.2 自發性內臟疼痛評分

環磷酰胺腹腔注射48 h 后,將大鼠置于安靜環境中,避免一切不必要的噪音,同時在進行評分前給予足夠的時間適應實驗室環境。 參照文獻[14],將大鼠單獨放入透明觀察籠內,疼痛行為的觀察及打分按下述標準執行:毛色光亮,活動正常=0 分;皮毛缺乏光澤伴毛發豎立=1 分,呼吸急促費力伴活動減少=2 分;精神萎靡伴眼上瞼下垂=3 分;蹲坐不動且舔撫腹壁=4 分;跛行或弓背蜷縮=5 分。 上述行為持續1 min以上即進行記錄,連續觀察2 h,累積相加得出疼痛評分。 由兩位研究者獨立評分,再進行比較分析。

1.3.3 Von-Frey 軀體疼痛測定

參考文獻方法[15],將大鼠單獨放置于透明樹脂包圍的不銹鋼網底鼠籠內,使用校正過的不同粗細的 Von-Frey 纖毛(1 g,1.4 g,2 g,4 g,6 g,8 g,10 g,15 g,26 g)按up-down 法垂直刺激大鼠足底和下腹盆部正中膀胱體表區域。 大鼠出現以下行為則認定為盆部區域刺激陽性反應:腹部急劇回縮、跳躍或者刺激后立即舔觸、搔抓盆部皮膚;急劇縮腿或用舌頭舔足則認定為足底刺激陽性。 每個區域重復3 次,取最低值作為機械痛閾。

1.3.4 尿動力學測定

烏拉坦(質量分數20%,1 g/kg 體重)腹腔麻醉成功后,大鼠取仰臥位,消毒外陰后經尿道置入PE50 管。 打開生理記錄儀儀并取實驗臺平面置零。將測壓導管、微量輸液泵及尿動力儀與三通相連。按壓排空膀胱后,生理鹽水以10 mL/h 的速度灌注膀胱,生理記錄儀描計膀胱充盈過程中膀胱內壓力變化, 標記開始灌注和出現排尿的時間。 排尿開始即停止灌注,排尿后輕壓下腹部排空膀胱 , 排出的尿液作為膀胱殘余尿量 。 每只大鼠至少測定3 個排尿周期。 最大膀胱容量=灌注時間×灌注速率;排尿容積則根據公式1 g = 1 mL 換算獲得;最大膀胱壓、膀胱基礎壓、閾值膀胱壓、非排尿性膀胱收縮均從生理記錄儀記錄的動態壓力記錄數據中分析獲取。

1.3.5 膀胱大體標本觀察

大鼠結束尿動力學測定后打開腹腔,切取膀胱。 棉簽輕拭吸取殘存尿液后,使用電子天平秤量新鮮膀胱組織重量和游標卡尺測量膀胱頂部中心厚度后記錄數據。 同時,體視顯微鏡下觀察并采用1999 年Assreuy 等[16]提出的標準評估膀胱水腫和出血嚴重程度來評價膀胱炎癥程度。 每例標本分兩份,1 份質量分數為4%的多聚甲醛溶液固定,用于組織切片HE 染色,另一份置于液氮中保存用于分子生物學實驗。

1.3.6 膀胱組織學評估

膀胱組織常規石蠟包埋切片,HE 染色,光鏡下觀察膀胱壁粘膜層和肌層的水腫、滲出、出血及炎性細胞增多等炎癥表現。

1.3.7 IL-1β mRNA 的 PCR 檢測

自液氮罐中取出組織,冰上解凍后采用TRIzol法抽提總RNA,進行 RNA 純度分析后,取3 μg 總RNA 根據試劑盒說明書逆轉錄合成第一鏈cDNA。根據試劑盒說明書操作,運用SYBGreen 染料作為指示劑,以 β-actin 作為內參(引物序列 5’ -CGTTGACATCCGTAAAGACCTC/TAGGAGCCAGGG CAGTAATCT-3’),利用 IL-1β 特異性引物(引物序列 5’ -CCTCGTGCTGTCTGACCCAT/ GACAAACCGC TTTTCCATCTTC-3’)實時定量擴增目標DNA,采用2-△△Ct法比較分析各組大鼠膀胱組織內 IL-1β 的表達水平。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 一般觀察及自發性內臟和軀體痛覺評估

CYP 注射后,200 mg/kg、250 mg/kg 組和 300 mg/kg 組分別有 1 只、4 只和 5 只大鼠在 48 h 內死亡。 如圖 1 所示,50 mg 和 100 mg CYP 腹腔注射并不引起大鼠自發性內臟疼痛,軀體痛覺閾值測試同樣發現50 mg 和100 mg 組與對照組無明顯統計學差異。 150 mg、200 mg、250 mg 和 300 mg CYP 腹腔注射均顯著(P< 0.05)增加大鼠的自發性內臟疼覺(圖1A) 和降低軀體疼痛閾值 (圖1B) 。

圖1 不同劑量CYP 腹腔注射對大鼠疼痛感覺的影響Note. A, Spontaneous visceral pain. B, Somatic nociception. n =10/10/10/10/9/6/5.Figure 1 Impact of cyclophosphamide on rat sensitivity to pain sensation

2.2 各劑量組大鼠尿動力學測定結果

如表1 所示,環磷酰胺腹腔注射后48 h 行尿動力學測定發現,與對照組相比較,50 mg 組大鼠膀胱功能未見明顯改變;100 mg 組大鼠殘余尿量明顯增多(P< 0.05),最大膀胱容積和最大膀胱壓未見明顯改變;150 mg 和200 mg 組大鼠最大膀胱容量較對照組明顯減少(P< 0.05),而殘余尿量明顯增多(P< 0.05),同時最大膀胱壓未見明顯改變;250 mg和300 mg 組大鼠的最大膀胱容量明顯減少(P<0.05),殘余尿量明顯增多(P< 0.05),而最大膀胱壓明顯下降(P< 0.05)。 綜上說明,50 mg CYP 腹腔注射不影響膀胱功能,100 mg、150 mg 和200 mg CYP 腹腔注射引起膀胱功能紊亂,但不影響膀胱收縮力,而250 mg 和300 mg CYP 腹腔注射明顯破壞膀胱收縮力。

表1 大鼠尿動力學參數Table 1 Rat urodynamic parameters

2.3 膀胱炎性改變

2.3.1 大體標本觀察

如表2 所示,50 mg 和100 mg 組大鼠膀胱重量、厚度和出血與對照組未見明顯差異,而150~300 mg CYP 腹腔注射均顯著(P< 0.05)增加大鼠膀胱重量和厚度,同時引起明顯的膀胱組織水腫和出血(P< 0.05)。

表2 大鼠膀胱炎癥參數Table 2 Inflammation parameters of rat bladders

2.3.2 組織學改變

如圖2 所示,50 mg 組(A)大鼠膀胱基本沒有炎癥改變,100 mg 組(B)部分區域可見粘膜水腫,未見出血及壞死;150 mg 組(C)和200 mg 組(D)開始出血較廣泛水腫及局灶性出血,主要累及粘膜和粘膜下層,肌層可見水腫但無明顯出血壞死性改變;250 mg 組(E)和300 mg 組(F)出現廣泛水腫及嚴重出血壞死,累及肌層,可見肌纖維腫脹,部分區域伴隨肌組織溶解。

圖2 大鼠膀胱組織切片HE 染色Note. A, Control group. B,50 mg group. C,100 mg group. D,150 mg group. E, 200 mg group. F, 250 mg group. G/H, 300 mg group. n = 6/6/6/6/6/6/5.Figure 2 Rat bladder sections stained with haematoxylin and eosin

2.4 IL-1β 的表達

如圖3 所示,50 mg 組和100 mg 組大鼠膀胱內IL-1β 的表達較對照組未見明顯差異,而150 mg、200 mg、250 mg 和 300 mg CYP 腹腔注射均顯著(P< 0.05)增加大鼠膀胱內IL-1β 的表達,證實炎癥反應的存在。

3 討論

間質性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征是無明確下尿路感染和病變而出現與膀胱充盈相關的疼痛癥狀,伴有其他排尿異常癥狀如尿頻、尿急、夜尿增多等的一種臨床綜合征,IC/BPS 病人的最主要癥狀是恥骨上區的疼痛和下尿路癥狀[17-18]。 然而,IC/BPS的發病機制目前在很大程度上仍未闡明,基于實驗動物模型的相關研究在認識IC/BPS 的病理和病理生理中發揮著重要作用。

腹腔注射環磷酰胺誘導的大鼠膀胱炎模型由于較好的模擬了IC/BPS 的兩大特征-疼痛過敏和膀胱炎癥而被廣泛用于IC/BPS 的研究[4,7],但文獻報道中采用多種劑量用于大鼠模型的建立使得基于非一致模型的研究成果難以整合。 本文作者選擇雌性成年大鼠作為實驗對象,用50 mg/kg 至300 mg/kg 的梯度濃度CYP 行腹腔注射誘導膀胱炎模擬IC/BPS,從病理生理和器官功能兩個角度對模型進行量化分析,系統性闡明了不同劑量CYP 腹腔注射建立IC/BPS 模型的病理生理和行為特征。 如圖1 和圖2 所示,50 mg/kg CYP 腹腔注射不引起膀胱炎性改變和大鼠痛覺敏化,顯然不是建立大鼠IC/BPS 模 型 的 理 想 選 擇。 Lantéri-Minet 等[19]和Boucher 等[14]使用雄性大鼠腹腔注射100 mg/kg CYP 發現,CYP 腹腔注射成功誘導大鼠膀胱出現顯著的炎癥改變并導致雄性大鼠內臟疼痛。 而我們基于雌性大鼠卻發現,100 mg/kg CYP 雖然引起雌性大鼠一定程度的膀胱組織學炎癥和功能紊亂(圖2 和表1),但未升高其膀胱組織IL-1β 水平和誘發自發性內臟疼痛及敏化軀體痛覺(圖1 和圖3),說明性別差異在建立大鼠IC/BPS 模型時值得重視。與前期研究一致,我們發現150 mg/kg 和200 mg/kg CYP 腹腔注射較對照組引起顯著的膀胱炎性改變和功能紊亂(圖1 和圖3),并且誘發大鼠內臟疼痛過敏和軀體痛覺敏化(圖1),較好的重現了IC/BPS的兩大臨床癥狀,然而我們在200 mg/kg 組觀察到大鼠死亡[14,20]。 既往研究發現CYP 腹腔注射后,膀胱炎性病理改變隨著 CYP 劑量的增加而加重[14],但更高劑量的CYP 腹腔注射是否更適合用于大鼠IC/BPS 模型建立未見報道。 我們發現,250 mg/kg 和300 mg/kg CYP 腹腔注射雖然引起顯著的膀胱炎癥和膀胱痛覺過敏(圖1 和圖2),也引起膀胱組織IL-1β 顯著升高(圖3),但病理檢查提示存在膀胱逼尿肌損傷且尿動力學測定提示膀胱收縮能力受損(圖2 和表1),這些改變明顯與IC/BPS 的臨床特征不符,同時兩組均觀察到高比率的(4/10只和5/10 只)大鼠48 h 內死亡。

圖3 IL-1β 在大鼠膀胱內的表達Note. Compared with control group,*P< 0. 05,n = 6/6/6/6/6/6/5.Figure 3 Expression of IL-1β in rat bladders

由于150 mg/kg 體重CYP 腹腔注射建立的大鼠IC/BPS 模型較好的兼顧了IC/BPS 的組織學病理改變和疼痛敏化的功能改變,并且在觀察期內未見大鼠死亡,推薦作為建立大鼠IC/BPS 模型的理想劑量。 此外,大鼠性別是影響CYP 腹腔注射誘導建立IC/BPS 模型的重要因素。 由于臨床上絕大多數IC/BPS 發生于女性患者,且本文數據支持性別差異與CYP 腹腔注射誘導的大鼠內臟和軀體痛覺過敏相關,因此有理由認為,雌性大鼠是利用CYP腹腔注射建立IC/BPS 模型的更佳選擇。 然而,年齡及飼養條件等因素是否也影響大鼠CYP 腹腔注射誘導建立IC/BPS 模型雖然截至目前未見相關文獻報道,需要進一步探索。 綜上,作者推薦基于雌性大鼠采用150 mg/kg 體重CYP 腹腔注射作為建立IC/BPS 模型開展科學研究的理想方法。