三葉鬼針草乙醇提取物抗菌抗氧化活性研究

孫成賢 林雄平 陳澤莉

摘 要：采用無水乙醇作為溶劑，從三葉鬼針草根、莖、葉及全草提取活性物質，并對得到的三葉鬼針草提取物進行體外抗菌及抗氧化試驗。結果表明：三葉鬼針草的根、莖、葉及全草乙醇提取物的提取率分別為5.90%、8.10%、11.40%、6.90%。三葉鬼針草不同部位的乙醇提取物均未呈現良好的抗菌活性，其中，僅葉提取物對枯草芽孢桿菌有輕微的抑制效果，抑菌圈為7.92mm。三葉鬼針草根、莖、葉等部位提取物均具有較好的抗氧化活性，其中，濃度為0.2mg/mL的乙醇提取物清除過氧化氫能力較好，根為701.76U/mL，莖為607.41U/mL，葉為271.30U/mL，全草為257.97U/mL，說明根部是貯存抗菌抗氧化活性物質的主要器官。由此可見，三葉鬼針草具有較強的抗氧化活性，可作為藥用植物資源進行開發和利用。

關鍵詞：三葉鬼針草;乙醇提取物;抗菌活性;抗氧化活性

中圖分類號 S567文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2021）11-0032-04

Studied on the Antimicrobial and Antioxidant Activities of the Ethanol Extracts from Bidens pilosa L.

SUN Chengxian et al.

（College of Life Science， Ningde Normal University， Ningde 352100， China）

Abstract： The roots， stems， leaves and whole herbs of the Bidens pilosa L.were extracted with ethanol. The antimicrobial and antioxidant activities of the extracts were tested in vitro. The results showed that the extraction rates of ethanol extracts from the roots， stems， leaves and whole herbs of Bidens pilosa were 5.90%， 8.10%， 11.40% and 6.90%， respectively. Ethanol extracts from different parts of Bidens pilosa did not show a good antimicrobial activity. Among them， only leaf extract had a weak inhibitory effect on Bacillus subtilis with an inhibitory circle of 7.92mm. Among the antioxidant activities of ethanol extracts from different parts of Bidens pilosa， the roots， stems and leaves of Bidens pilosa had better antioxidant activities. When the concentration of ethanol extract was 0.2mg/mL， the effect of hydrogen peroxide removal was better and the root， stem， leaf， and herba are 701.76U/mL， 607.41U/mL， 271.30U/mL and 257.97U/mL， respectively. Therefore， the root was the main organ for storing antimicrobial and antioxidant substances. Bidens pilosa could be used as medicinal plant resources for development and utilization for strong antioxidant activity.

Key words： Bidens pilosa L.; Ethanol extract; Antibacterial activity; Antioxidant activity

三葉鬼針草（Bidens pilosa L.）是一年生菊科草本植物，屬于管狀花亞科鬼針草屬，也被稱為毛針草、細毛針草[1]。植物高25～100cm，桿是直立，切斷面為四邊形，疏柔毛或無毛。廣泛分布于我國長江以南地區，易存活，屬于廣泛生態類型的植物，常生長在荒地、山坡、河流旁等地方。其生長周期短，容易識別，可在夏、秋季采摘，將其陽光下曬干或直接藥用，其分布較集中，易于采栽，是一種理想的可供開發的天然藥物[2]。三葉鬼針草性平，味苦，在民間應用范圍很廣，不僅可以用于消除紅腫減輕疼痛、治療皮炎，還可用于胃腸炎癥，中暑腹痛，細菌性痢疾，急性喉炎，感冒發熱，淋證，白濁等疾病，具有抗炎、抗菌、抗癌等作用[3]。除此之外，鬼針草還具有解熱、體外抗病毒的作用，表現為抑制甲型和乙型流感病毒[4]。現在許多老年人患有心血管疾病，高血壓就是一種常見的心臟負擔變重引起的并發癥，鬼針草對血壓疾病有雙向調節作用，對高血壓的并發癥也有一定的控制效果[5]。

當前，三葉鬼針草的研究與利用主要集中在藥效作用、化學組成成分及細胞學方面等，而有關三葉鬼針草提取物的抗氧化和抑菌作用的研究仍較少。為此，本研究以三葉鬼針草的全草、莖、葉、根的乙醇提取物為試驗材料，選用食品腐敗常見的黑曲霉菌、啤酒酵母菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌為受試菌，研究了三葉鬼針草乙醇提取物的抗氧化性和體外抑菌活性，以期為天然新型食品防腐劑和抗氧化劑的篩選原材料，促進鬼針草植物資源更有效地利用。

1 材料與方法

1.1 材料 三葉鬼針草采自福建省寧德市蕉城區寧德師范學院舊校區。受試菌來自寧德師范學院微生物實驗室，真菌菌種為黑曲霉菌[Aspergillus niger v. Tiegh]、啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae Han-sen）;細菌菌種為大腸桿菌[Escherichia coli （Migula） Casleillni and Chalmers]、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus Rosenbach）、枯草芽孢桿菌[Bacillus subtilis（Ehren-berg）Cohn]。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 將三葉鬼針草洗干凈后挑取為根、莖、葉及全草4個部分，置于45℃恒溫干燥箱烘干，中草藥粉碎機將其粉碎，過60目篩，制成三葉鬼針草的根、莖、葉、全草4種干粉。

1.2.2 三葉鬼針草不同部位活性物質提取 采用以下方法進行三葉鬼針草乙醇提取物的制備：分別稱取三葉鬼針草的根、莖、葉、全草各3g，按照料液比1∶10（m/v）加入無水乙醇浸提，在60℃水浴鍋中加熱提取24h，過濾，同法提取兩次，合并提取液，得到的提取液在60℃水浴條件下將其蒸干至恒重，得到3次乙醇提取物后分別稱其質量。

1.2.3 三葉鬼針草不同部位乙醇提取物的抗菌活性測定 配制三葉鬼針草的根、莖、葉和全草的乙醇提取物及山梨酸鉀溶液，濃度為0.1g/mL，溶劑為無菌蒸餾水。采用文獻[6]圓形紙片法進行抗菌試驗，每組試驗設2個重復組，測定抑菌圈的直徑大小，取3次數據平均值。

1.2.4 三葉鬼針草不同部位乙醇提取物的抗氧化活性測定 依據過氧化氫酶測試盒說明書，實驗中在分光光度計波長405nm處測定鉬酸可以與過氧化氫作用生成一種絡合物的生成量，可計算出過氧化氫的量。具體操作步驟嚴格按照測試盒說明書進行，將三葉鬼針草不同部位提取物用蒸餾水分別稀釋100倍（濃度為10mg/mL）的溶液，按照文獻[7]進行抗氧化試驗，對三葉鬼針草乙醇提取物的抗氧化活性重復3次進行測定的吸光度值，分析差異。

2 結果與分析

2.1 三葉鬼針草不同部位活性物質的乙醇提取率 將3次重復實驗中三葉鬼針草的乙醇提取結果進行整理計算所得的數據制成柱形圖，如圖1所示。由圖1可知，三葉鬼針草不同營養器官無水乙醇的提取率從高到低依次為：葉>莖>全草>根。其中，葉的提取率最高，達到11.40%;其次為莖8.10%，根低于全草為5.90%，全草為6.90%。

圖1 三葉鬼針草不同部位的提取率

三葉鬼針草主要的營養器官是葉，它是制造有機養料的重要器官，是進行光合作用和呼吸作用的主要場所，其中某些酶和呼吸酶便是用于其進行光合作用，同時葉也是儲存維生素、淀粉等營養物質的主要場所，這可能是葉部位提取率最高的原因;莖的提取率高于根，這可能是因為莖部位的生理代謝比根部位更加活躍，并且有許多物質可以被乙醇溶解;除此之外，全草提取率高于根，卻低于葉和莖，說明可能是全草中根所占比較多，而莖和葉所占比較少，從而全草被乙醇溶出的物質比根多而比莖和葉少。出現上述情況也有可能與提取所用的溶劑有關。

2.2 三葉鬼針草不同部位乙醇提取物的抗菌活性 由表1可知，三葉鬼針草提取物在0.1g/mL濃度時，除了葉、全草對枯草芽孢桿菌有輕微的抑制作用，其他部位的乙醇提取物對四種受試菌均無出現抑菌圈。由此可見，試驗中三葉鬼針草的乙醇提取物無明顯的抗菌活性。

比較三葉鬼針草不同部位的乙醇提取物對受試菌的抗菌活性發現，只有葉和全草表現出抗菌活性，這可能與植物各器官所處的環境有關，也可能是全草中葉所占的含量較多導致全草和葉表現出的抑菌效果相同。葉和全草對枯草芽孢桿菌表現出抑菌效果，抑菌圈直徑為7.92mm。

同等濃度的山梨酸鉀在試驗中除了對金黃色葡萄球菌和黑曲霉菌無抑制能力之外，對其他3種受試菌種均呈現出輕微的抗菌活性。其中，抗菌活性從高到低依次為：枯草芽孢桿菌>大腸桿菌>啤酒酵母菌，這3種受試菌的抑菌活性都只表現微弱。可能是由于提取物濃度過低，使得山梨酸鉀的效果弱化。比較真菌與細菌的抑菌圈直徑，山梨酸鉀對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和啤酒酵母菌的抗菌作用結果表現相近。

三葉鬼針草的乙醇提取物最終表現為無明顯抗菌活性的可能原因有：所用的乙醇的濃度、乙醇的用量及提取時間和次數對鬼針草的提取物的影響，使得所得提取物中黃酮類含量較少，三葉鬼針草抑菌活性成分主要為黃酮類化合物，建議之后可以在控制單一變量法情況下，尋找最佳的乙醇提取濃度，或者探究最佳的醇提取工藝;鬼針草中含有多種抑菌活性物質，提取物中具有抑菌成分的濃度較低，結果無明顯抑菌圈出現即不表現抑制作用，建議設置對照試驗尋找最適的抑菌濃度;提取物中有效的抑菌物質隨著時間的延長而被分解，建議在之后的研究可以加入時間因素的控制;不同受試菌表現出抑菌作用和抑菌作用的明顯狀況受溫度、時間和提取物濃度的影響，本試驗操作的條件未能使5種受試菌表現明顯的抑菌作用。

2.3 三葉鬼針草不同部位乙醇提取物的抗氧化活性 由3次重復試驗測得數據，計算三葉鬼針草乙醇提取物的抗氧化能力制成柱形圖，如圖2所示。

根據試驗計算結果，三葉鬼針草不同部位乙醇提取物的抗氧化能力由強到弱的排序為：根>莖>葉>全草，由形態學從下向上大致表現為遞減的趨勢，根部為701.76U/mL，抗氧化性最強，莖部為607.41U/mL，葉部為271.30U/mL，全草為257.97U/mL。結合前面的提取率分析，發現根部乙醇提取率較低，但表現出較強的抗氧化活性;然而葉部的乙醇提取率較高，但抗氧化活性較低。可以看出，鬼針草提取率與其抗氧化能力之間沒有直接關系。由于根與莖的部位抗氧化活性成分積累較多，而本試驗與生產和治療相關疾病的實踐結果表現一致，根部的抗氧化活性成分含量豐富，即根部發揮的藥效大于莖，并且莖大于葉。同時也說明三葉鬼針草的藥效成分積累及發揮其作用的主要部位是根，這也是由于植物在生長過程中根通常能夠進行具有活性的次生代謝物的積累。現在很多名貴藥材的成分大多是從植物根部提取，根部成分表現的價值在藥學植物中所發揮的作用不容小覷。試驗結果中全草的抗氧化能力是最低的，可能是全草中葉所占的比例較高而根和莖所占的比例較低，這與抗菌試驗結果類似。

3 討論

針對不同植物的活性成分提取可選用不同的提取劑，不同的提取劑得率有所差異。梁雪芳等[8]實驗得出三葉鬼針草總黃酮在乙醇濃度為80%，超聲處理2次的工藝為較優提取方法，結果總黃酮的平均提取為1.801%。李媛媛等對鬼針草莖中總黃酮的提取是采用70%的濃度，提取率為0.95%。陳豪[9]對三葉鬼針草不同生長期研究表明，鬼針草在60%乙醇提取物中莖葉期和結果期總黃酮提取率分別為4.786%、4.247%，且葉片中總黃酮含量較高，莖中總黃酮含量較少，所以試驗結果認為可以選擇鬼針草葉片部位進行黃酮類成分的開發利用。而本試驗中三葉鬼針草的根、莖、葉和全草的乙醇提取物提取率分別為11.40%、8.10%，6.90%、5.90%。由此可以看出，該試驗中與其他研究中總黃酮的提取率有較大差別，可能是在該試驗條件下乙醇提取物中還含有其他成分影響最終提取率，除濃度、時間、溫度外，乙醇提取過程受pH、UV等的影響，導致提取率的結果差異。

自然界中有許多植物具有抗菌活性，植物體內存在黃酮類、生物堿、有機酸等次生代謝產物具有殺菌能力，植物源黃酮類物質具有廣譜抑菌性[10]。曹銘晨等[11]對鬼針草屬的抑菌實驗表明，鬼針草乙酸乙酯部位總黃酮對金黃色葡萄球菌具有較好的抑菌效果，抑菌圈達10.58mm，而對大腸桿菌無抑菌效果。滕蓉等[12]研究表明，70℃鬼針草醇提物對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別達10.76mm、9.63mm，其中對枯草芽孢桿菌的抑菌具有強且穩定的效果，對大腸桿菌無抑菌效果。由本試驗抗菌結果可知，三葉鬼針草的葉和全草的乙醇提取物表現出微弱的抑制能力，抑菌圈直徑達到7.92mm.鬼針草的其他部位在實驗中均無明顯現象。同等濃度的葉及全草的乙醇提取物對常見食源性致病菌枯草芽孢桿菌有抑制效果，這與其他相關研究結果一致，只是抑菌效果比較不明顯。相同濃度的山梨酸鉀溶液對啤酒酵母菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌表現出抑制作用。整體抗菌結果未表現良好的抑菌效果，可能原因是所用提取的乙醇濃度、用量、提取時間等影響鬼針草成分的提取，所提取的黃酮類含量少，因為根據滕蓉等的研究表明鬼針草抑菌活性成分主要為黃酮類化合物;也可能是鬼針草中的抑菌活性成分除了黃酮類化合物還有其他成分，而所得的提取物中抑菌活性成分較少;也可能是鬼針草醇提取物中的物質相互拮抗;還有可能是5種受試菌表現出抑菌作用的條件受溫度、時間、外界多種環境的影響等，使得結果未表現出較好的抑菌作用。建議以后的研究可以鬼針草提取物的純化分離入手，尋找提取物最適濃度進行探究對常見受試菌的抑菌效果，深入對中藥材的成分研究和利用。

據文獻報道，鬼針草的乙醇提取物與水溶性的維生素C相比具有較為顯著的抗氧化活性。蔣海強等[13]通過實驗表明，鬼針草總黃酮具有明顯清除自由基作用，總黃酮起抗氧化作用的主要活性基團是酚羥基，可通過酚羥基使抗氧化性增強。滕蓉等[12]研究的抗氧化實驗結果中鬼針草石油醚萃取物清除超氧陰離子能力較強，是VC的68.9%，而鬼針草正丁醇提取物清除DPPH效果較好，是VC的92.8%，結果表明，鬼針草具有較強的抗氧化能力。楊秀東等[14]采用不同溶劑的鬼針草提取物對DPPH清除能力的實驗中，得出當濃度為0.2mg/mL時，鬼針草的乙酸乙酯萃取物的清除率為87.2%，高于其他溶劑的提取物，且表明鬼針草的抗氧化能力較好。從該三葉鬼針草的抗氧化實驗結果可知，三葉鬼針草的根、莖、葉和全草的部位均表現出抗氧化能力，其抗氧化能力由強到弱的順序為：根>莖>葉>全草，可從植物形態學來看是從下向上呈現出遞減的趨勢。據本實驗結果可知，鬼針草的根部的乙醇提取物抗氧化活性最強，均強于莖、葉和全草，從抗氧化能力方面來分析，根所含的抗氧化活性物質相對莖和葉更多。對于鬼針草細分部位的抗氧化研究報道較少，但是在民間許多名貴的藥材都取自于植物的根部，多數植物的根部成分具有良好的藥效，三葉鬼針草是一類自然植物，材料豐富易采栽，成本低，根可以作為藥材使用，其莖、葉及全草也可以為天然抗氧化劑的研究和生產提供原材料。

通過對本試驗結果分析得出，鬼針草的提取率與其抗氧化活性物質的含量沒有一定的聯系，也可推測植物中同屬不同種的成分含量是有差異的。本試驗對三葉鬼針草的不同部位進行了細分，將植株不同部位的乙醇提取物分別進行抗菌抗氧化研究，對開發研制天然防腐劑提供參考依據，對于未來相關藥用植物的生產和研究也具有一定的積極作用。參考相關研究文獻，未發現對鬼針草中抑菌活性單體成分的研究，建議今后可以在醇提取總黃酮中分離單體，進一步探究有關抗菌抗氧化活性成分的機制及影響因素。目前，關于鬼針草屬的抗菌抗氧化研究都未對植株的各個部位進行細分，對相關藥品的開發和生產的指導方向具有較大的局限性，可通過選擇合理的提取工藝將其中的活性物質分離提純，并考慮成本和時間的同時尋找提取物最適合的濃度和劑量，作為天然防腐劑用于食物的防腐方面。三葉鬼針草中含有黃酮類化合物，現在許多研究將植物類黃酮抗氧化和保健作用相聯系，證明生物類黃酮具有抗動脈粥樣硬化、抗病毒、抗腫瘤等治療疾病的功能。若將抗氧化劑進行復合，它可以清除人體內的自由基、改善體內循環系統、延緩容顏器官衰老等多種功效。

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（責編：張宏民）