β-胡蘿卜素殼聚糖納米粒制備工藝優化

隨蘭多 王煜 鮑獻杰 黃蘭蘭 葉貝 李妍

摘 要：以β-胡蘿卜素為試驗材料，通過離子交聯法構建β-胡蘿卜素納米粒，在不同藥載比、溫度、pH下研究其載藥率和包封率的變化趨勢，并對其進行優化設計。結果表明：β-胡蘿卜素殼聚糖納米粒的載藥性能最佳工藝條件為藥載比6∶1、溫度30℃、pH 5，在此條件下包封率為61.74%，載藥率16.42%。由此可見，通過離子交聯法構建β-胡蘿卜素納米粒具有良好的包封率和載藥率。

關鍵詞：β-胡蘿卜素;殼聚糖;納米粒;載藥性能

中圖分類號 TS264.4文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2021）11-0137-04

Optimization the Preparation of β-Carotene-Chitosan Nanoparticles

SUI Landuo et al.

（College of Food and Bioengineering， Bengbu University， Bengbu 233030， China）

Abstract： In this experiment ，β-Carotene were constructed by ion crosslinking method to study their drug loading and encapsulation efficiency under different drug loading ratio， temperature and pH. The results showed that the best technological conditions for β-Carotene chitosan nanoparticles： the drug loading ratio was 6∶1， the temperature was 30℃， the pH was 5， the encapsulation efficiency was 61.74% and the drug loading was 16.42%. The experiment results showed that β-carotene chitosan nanoparticles were stable and the drug loading was good.

Key words： β-Carotene; Chitosan; Nanoparticles; Drug loading properties

類胡蘿卜素是一種天然色素，普遍存在于不同顏色的花卉、蔬菜、水果中，具有抗癌、降血壓、提高免疫力、抗氧化、延緩衰老等保健功效[1]。新鮮的水果和蔬菜富含大量的類胡蘿卜素，是人們獲取類胡蘿卜素的主要來源，但通過飲食攝取的類胡蘿卜素生物利用度不到5%[2]。食品中的類胡蘿卜素極其不穩定，易被氧化，且主要以結合蛋白的形式存在于葉綠體或色細胞等結構中[3]，經過一系列的反應釋放至消化系統中，然后才能被人體利用。因此，改變類胡蘿卜素的攝取途徑，提高類胡蘿卜素的生物利用度是目前重要的研究課題。殼聚糖（chitosan，CS）是一種天然的陽離子聚合物，自然界中來源豐富。其結構中有多個活性官能團可改性修飾，便于制成多種藥物遞送系統和組織工程支架，在生物醫藥領域應用廣泛[4]。另外，殼聚糖具有生物降解性、生物相容性、無毒性、增強免疫等多種生物功能，是良好的藥物載體材料[5]。納米技術是指在更小分子（如原子等）水平上的研究、制造并利用納米材料（尺寸在1000nm以內）的技術，在醫藥領域利用其分子結構小的特點，使許多生物活性物質可以利用納米技術來遞送[6]。.納米粒作為類胡蘿卜素的載體，在提高其生物利用度的同時，還能增加其在體內的穩定性。同時，納米粒技術能有效調節藥物釋放時間，尤其在藥物制劑領域，具有改善難溶性藥物溶解度、改善藥物穩定性等優點[7]。為此，筆者采用離子交聯法構建β-胡蘿卜素納米粒，確定最優的制備方案，以β-胡蘿卜素納米粒的包封率和載藥率為考察指標，為β-胡蘿卜素的應用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 β-胡蘿卜素（AR，上海源葉生物科技有限公司）;殼聚糖鹽酸鹽（食品級，山東優索化工科技有限公司）;殼聚糖（生化試劑，上海凱爾生物技術有限公司）;三聚磷酸鈉（食品級，湖北興發化工集團有限公司）;甘油、鹽酸、三氯甲烷，吐溫80、氫氧化鈉、無水氯化鈣（均為分析純）;一級純化水（實驗室自制）。

1.2 儀器與設備 TU-1901雙光束紫外可見光分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）;085-2A數顯恒溫測速磁力攪拌器（金壇市白塔新寶儀儀器廠）;DW-FL90冰箱（上海子卓儀器有限公司）;HH-4數顯恒溫水浴鍋（常州普天儀器制造有限公司）;FA214電子天平（上海海康電子儀器廠）;H4-20KR高速冷凍離心機（安徽中華中佳科學儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程 繪制β-胡蘿卜素標準曲線→殼聚糖納米粒的制備→β-胡蘿卜素殼聚糖納米粒的制備→包封率與載藥率的計算→制備工藝單因素考察→響應面法優化工藝條件→β-胡蘿卜素殼聚糖納米粒質量評價。

1.3.2 標準曲線的建立 由文獻得知，β-胡蘿卜素在波長455nm附近有吸收峰。準確稱取0.05g的β-胡蘿卜素用三氯甲烷溶解，并用三氯甲烷定容至500mL。移取2、4、6、8、10mL的溶液，三氯甲烷定容至10mL。依照上述操作可得0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/mL的β-胡蘿卜素。然后在波長455nm處測定吸光度（三氯甲烷為空白對照），繪制線性回歸方程：y=0.0138x+0.0150，R2=0.9982（圖1）。

1.3.3 β-胡蘿卜素納米粒的制備 殼聚糖-多聚磷酸鹽納米粒的制備：采用納米復合技術制備納米粒，即殼聚糖（CS）與多聚磷酸鈉（TPP）之間發生離子交聯反應：1mg/mL CS溶解于1%醋酸溶液→緩慢滴加10mol/L氫氧化鈉溶液，調節溶液pH為5→逐滴加入TPP溶液使CS/TPP質量比為5∶1，攪拌30min→獲得CS-TPP納米溶液。β-胡蘿卜素納米粒的制備：稱取不同質量的β-胡蘿卜素溶解于三氯甲烷中，轉速為600r/min，加入至CS-TPP納米溶液控制1d/s，滴加結束后向混合溶液中加入約占混合溶液總體積的2%的吐溫80，攪拌1.5h可得β-胡蘿卜素納米粒溶液。

1.3.4 包封率和載藥率的計算 （1）空白殼聚糖納米粒吸光度的測定：控制藥載比為1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10，pH為3、4、5、6、7，溫度為20、25、30、35、40℃，制備空白殼聚糖納米粒。移取2mL空白殼聚糖納米粒溶液用甲醇定容至10mL，靜置3h后，以甲醇為對照，在波長455nm處測吸光度。（2）β-胡蘿卜素納米粒吸光度的測定：保持600r/min攪拌1h后，移取2mL β-胡蘿卜素納米粒分別用甲醇和三氯甲烷定容至10mL，靜置2h后，在波長455nm處測吸光度。（3）離心后β-胡蘿卜素納米粒吸光度的測定：向離心管中加入β-胡蘿卜素納米粒溶液，調節高速離心機溫度為5℃，轉速為9000r/min，離心30min。取上清液2mL用三氯甲烷定容至10mL，靜置2h后在波長455nm處測吸光度。

包封率=[M1-M0M1]

載藥率=[M1-M0M2]

式中：M1為β-胡蘿卜素納米粒的總量;M2為殼聚糖納米粒的總量;M0為游離的β-胡蘿卜素納米粒的總量。

1.3.5 單因素試驗 （1）反應溫度。磁力攪拌處理時間：1.5h;，攪拌速度：600r/min;加入反應液總體積2%的吐溫80;改變磁力攪拌溫度：20、25、30、35、40℃;在反應pH為5，β-胡蘿卜素∶殼聚糖（M∶M）=4∶1的條件下，根據1.3.3節方法制備β-胡蘿卜素納米粒并測定吸光度，計算載藥率和包封率，平行3次。

（2）藥載比。磁力攪拌處理時間：1.5h;攪拌速度：600r/min;加入反應液總體積2%的吐溫80;改變β-胡蘿卜素∶殼聚糖（M∶M）=2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1;在反應pH5，攪拌溫度25℃的條件下，根據1.3.3節方法制備β-胡蘿卜素納米粒，并測定吸光度、計算載藥率和包封率，平行3次。

（3）反應pH。磁力攪拌處理時間：1.5h;攪拌速度：600r/min;加入反應液總體積2%的吐溫80;改變反應pH：3、4、5、6、7;在β-胡蘿卜素∶殼聚糖（M∶M）=4∶1，攪拌溫度為25℃條件下，根據1.3.3節方法制備β-胡蘿卜素納米粒，并測定吸光度，計算載藥率和包封率，平行3次。

1.3.6 響應面法優化提取工藝 根據單因素試驗結果得出溫度、pH、藥載比對納米粒的包封率影響較為明顯，采取Box-benhnken設計[9]試驗，以溫度、pH、藥載比作為自變量，以β-胡蘿卜素殼聚糖納米粒的包封率與載藥率為試驗結果，表1為試驗因素水平編碼。

1.3.6 驗證試驗 通過分析響應面優化試驗數據，得出β-胡蘿卜素殼聚糖納米粒的最佳制備條件，并重復3次，取3次平均值與模型預測的理論值進行比較。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 pH 保持藥載比與溫度為不變量，控制pH為單因素變量，得到在不同pH下β-胡蘿卜素納米粒的包封率與載藥率的變化情況。由圖2可知，包封率與載藥率隨pH的不斷增大表現先上升后下降的變化趨勢，pH=5時包封率和載藥率達到最大。根據庫侖定律，判斷pH=5時粒子之間的吸引力最強，對納米粒形成和穩定最有利[8]，有利于β-胡蘿卜素和殼聚糖發生離子交聯，隨著pH的增大，交聯聚合物表面的電荷降低。在pH=5時沒有發生電荷翻轉，粒徑也變化不大[9]。

2.1.2 溫度 保持藥載比與pH為不變量，控制溫度為單因素變量，得到在不同溫度下β-胡蘿卜素納米粒的包封率與載藥率的變化情況。由圖3可知，溫度在25～35℃時，包封率和載藥率均呈現明顯的上升態勢，溫度為35℃時包封率和載藥率均達到最高;當溫度大于35℃時，包封率和載藥率又表現下降趨勢。這可能是由于隨著溫度的上升，殼聚糖分子熱運動增加，相互碰撞和凝聚作用增大[10]，此時形成的納米粒子穩定性升高，但溫度的持續升高破壞了納米粒載體結構，達到了納米粒的沉積溫度，使得納米粒聚集[11]，不利用納米粒的載藥與釋藥。

2.1.3 藥載比 保持溫度與pH為不變量，控制藥載比為單因素變量，得到在不同藥載比下β-胡蘿卜素納米粒的包封率與載藥率的變化情況。由圖4可知，當藥載比（X∶1）不斷增大時，β-胡蘿卜素納米粒的包封率也不斷增大，當藥載比=6時包封率達到最大值，此后包封率隨藥載比的不斷增大呈下降趨勢。在此過程中，小部分納米粒開始聚集，逐漸形成大顆粒[12]，即此時的納米粒載體仍能繼續包裹與負載藥物[13]，但當藥載比=6，達到了納米粒載體的最大限度，繼續增大藥物的量，包封率與載藥率則不再繼續增大，反而出現下降趨勢。由于溶液剩余的藥物未被納米粒載體包裹與負載，使得藥物不斷聚集[14]，降低了納米粒載體的穩定性，從而使得包封率與載藥率下降。

2.2 響應面法設計及結果 根據單因素試驗結果，利用響應面軟件Box-Behnken試驗原理設計，以溫度、藥載比、pH為自由變量，以β-胡蘿卜素殼聚糖納米粒的包封率和載藥率為響應值（表2）。采用Design Expert 8.0.6，對表2數據進行二次多元回歸擬合，得出β-胡蘿卜素殼聚糖納米粒的包封率和載藥率二次回歸方程∶Y=20.10+0.15A-0.47B+0.33C-0.14AB+0.12AC-0.055BC-3.79A2+0.88B2-2.50C2。

由表3得出，A、B、C 3個因素對模型作用結果大小為B>C>A，該回歸模型極為顯著（Pr>F小于0.01）模型失擬項P=0.110>0.05，失擬不顯著，表明該模型的建立和試驗數據的模擬程度一般。利用軟件Box-Behnken得出β-胡蘿卜素殼聚糖納米粒制備的最佳工藝參數為溫度30℃、藥載比6∶1、pH 5。在最優制備工藝條件下，β-胡蘿卜素殼聚糖納米粒的包封率為61.74%，載藥率為16.42%。

采用SPSS統計學軟件對pH、溫度、藥載比進行單因素分析，所有試驗結果均以X±s表示，各試驗組采用LSD驗算，P≤0.05，具有統計學意義。

2.3 優化試驗結果 當反應體系溫度為30℃、藥載比為6∶1、pH為5時為最優反應條件。對其進行優化，如表4所示。

3 結論與討論

采用離子交聯法構建β-胡蘿卜素納米粒，以反應體系溫度、藥載比、反應體系的pH為單因素進行試驗，得出3個單因素對β-胡蘿卜素納米粒的包封率與載藥率的影響。結果表明：β-胡蘿卜素納米粒的最佳工藝為反應體系溫度30℃、藥載比6∶1、反應體系pH5，在此條件下進行優化試驗得到包封率為66.49%，載藥率為20.10%，相對誤差為1.6%。本試驗建立的β-胡蘿卜素納米粒制備方法，包封率和載藥率較好，條件穩定可靠。

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（責編：徐世紅）