鹿角杯形珊瑚溶菌酶PdLYZ重組蛋白的表達及其體外抑菌活性特征

唐 佳，倪興振，邢皓程，王佑笑，楊倩曦，閆智聰，周 智，趙建民

（1. 中國科學院 煙臺海岸帶研究所，山東 煙臺 264003; 2. 中國科學院大學，北京 100049;3. 海南大學 海洋學院，?？?570228; 4. 海南華僑中學，海口 570226）

珊瑚礁生態系統是重要的海洋生態系統之一，棲息著全球多達四分之一的海洋生物，被譽為“海洋中的熱帶雨林”，為人類提供了食物、生態和社會經濟文化等服務[1-2]。造礁石珊瑚是珊瑚礁生態系統的支柱生物，其通過與蟲黃藻和細菌等微生物共生來適應強光照寡營養的礁區環境，因此維持健康的微生物群落結構對造礁石珊瑚的健康尤為重要。當前全球氣候變暖導致的海水升溫迫使造礁石珊瑚外排共生蟲黃藻，珊瑚因營養短缺而免疫力下降，機會致病菌[例如：溶珊瑚弧菌（Vibrio coralliilyticus）]的致病力相對顯著提升，造成了某些珊瑚疾病的爆發率顯著升高[3]。因此，亟需開展造礁石珊瑚免疫防御機制的相關研究，尤其是高溫對珊瑚免疫的影響。造礁石珊瑚與其他無脊椎動物一樣，依靠固有免疫應答來識別和清除入侵的病原菌等微生物[4]。此外，珊瑚還能通過固有免疫應答控制共附生菌群中病原菌的數量和比例，進而降低病原菌的潛在威脅[5]。珊瑚的凋亡、自噬、抗菌肽、氧化還原系統、酚氧化酶系統和補體系統等均參與了致病微生物的控制和清除[6-7]。抗菌肽是生物中普遍存在的一類陽離子活性多肽，是機體非特異性免疫的關鍵因子之一，目前已從多種無脊椎動物中分離出具有活性的抗菌肽[8]。近年來，分子生 物學和基因組學的迅猛發展促進了免疫相關基因的挖掘，更好地推動珊瑚固有免疫應答和共附生菌群調控的深入研究。溶菌酶屬于抗菌肽家族，是生物體內一種具有殺菌作用的重要抗菌蛋白，其通過催化水解細胞壁中N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之間形成的β-1，4糖苷鍵而破壞細菌的細胞壁[9-12]。目前，已有許多研究聚焦于無脊椎動物的溶菌酶，但對造礁石珊瑚，甚至刺胞動物中溶菌酶的了解還不清楚，僅有類溶菌酶活性的相關報道，且缺乏確切的分子證據[13-14]。例如，有研究表明受黃帶病影響的珊瑚（Orbicella faveolata）中具有較高的類溶菌酶活性[15]；海扇可能通過增加類溶菌酶和殼多糖酶活性抵抗微生物入侵[16]；華麗黃海葵（Anthopleura elegantissima）和等指?？ˋctinia equina）的粘液均具有類溶菌酶活性[17-18]。鹿角杯形珊瑚（Pocillopora damicornis）隸屬動物界（Animalia）、刺胞動物門（Cnidaria）、珊瑚綱（Anthozoa）、石珊瑚目（Scleractinia）、杯形珊瑚科（Pocilloporidae）、杯形珊瑚屬（Pocillopora），廣泛分布于太平洋和印度洋的熱帶和亞熱帶淺海海域。鹿角杯形珊瑚已作為模式生物用于探究造礁石珊瑚對病原菌，以及病原菌和高溫交互作用的響應研究中。例如，BEN-HAIM等[19]分離出一種溫度依賴型的溶珊瑚弧菌，該病原菌在水溫超過26 ℃時，可在2周內迅速破壞鹿角杯形珊瑚的組織[19]。筆者克隆了鹿角杯形珊瑚的溶菌酶基因PdLYZ，隨后體外誘導表達并純化PdLYZ重組蛋白，同時測定PdLYZ重組蛋白對大腸桿菌（Escherichia coli），變異鏈球菌（Streptococcus mutans）和溶珊瑚弧菌（V. coralliilyticus）的抑菌活性，還探究了PdLYZ重組蛋白在高溫條件下對病原菌溶珊瑚弧菌抑制活力的變化，從而揭示溶菌酶在珊瑚免疫應答中扮演的重要作用。

1 材料與方法

1.1 實驗生物鹿角杯形珊瑚采自文昌市銅鼓嶺岸礁，采后置于盛有500 L天然海水的玻璃缸中暫養1個月。暫養條件：溫度26 ℃，鹽度35，光照∶黑暗時間為12 h∶12 h。受試菌株：大腸桿菌（E. coli，A TCC 25922）、變異鏈球菌（S. mutans，ATCC 700610）和溶珊瑚弧菌（V. coralliilyticus，SCSIO 43001）。

1.2 實驗試劑DNA提取試劑Trizol購自美國invitrogen公司；逆轉錄試劑盒M-MLV Reverse Transcriptase Kit購自普洛麥格（北京）生物技術有限公司；PCR試劑、PCR克隆試劑盒（PMD19-T Vector Cloning Kit和MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit）購自寶生物工程（大連）有限公司；Trans5α感受態細胞、Trans BL21（DE3）pLysS化學感受態細胞和連接轉化試劑盒（pEASY-E1 Expression Kit）購自全式金生物技術有限公司；鎳瓊脂糖凝膠FF購自北京韋氏博慧色譜科技有限公司；其他試劑購自生工生物工 程（上海）股份有限公司或北京索萊寶科技有限公司。

1.3 鹿角杯形珊瑚總RNA提取和cDNA合成將珊瑚小枝置于液氮中充分研磨后加入1 mL Trizol，收集研磨液，將研磨液在5 000 g 4 ℃下離心5 min后去除珊瑚的碳酸鈣骨骼，然后參考STEFANIK等[20]報道的方法提取鹿角杯形珊瑚的總RNA。利用M-MLV Reverse Transcriptase Kit將RNA反轉獲得cDNA第 一鏈，將獲得的cDNA稀釋100倍后用于PdLYZ基因的克隆。

1.4 PdLYZ基因的克隆和序列分析基于本實驗室已測序和組裝的鹿角杯形珊瑚轉錄組文庫，采用局部序列排比檢索基本工具（basic local alignment search tool，BLAST）檢索到1條與其他已鑒定的溶菌酶基因同源的轉錄本，且該轉錄本的序列含有1個完整的開放閱讀框。為了擴增PdLYZ基因開放閱讀框的序列，利用引物設計軟件（Primer premier 5.0）設計2條特異性引物PdLYZ_F（5′-AAATGTGACCCAAAACC ATCGA -3′）和PdLYZ_R（5′-AATCAGCATCCAGCTTTAATGATT-3′）進行PCR擴增。PCR反應總體系為50 μL。擴增條件：94 ℃ 5 min，35個循環（94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min），72 ℃ 10 min。擴增產物4 ℃保存。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后用MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit進行純化，然后將該片段連接到PMD19-T載體中并轉化至Trans5α感受態細胞。挑選PCR鑒定為陽性的單克隆菌落進行測序以驗證序列。

使用BLAST工具在NCBI數據庫（http://www.ncbi.nlm.gov/blast）中檢索PdLYZ的同源基因和蛋白。利用ExPASy數據庫（https://web.expasy.org/compute_pi/）計算PdLYZ蛋白的理論等電點和相對分子量，采用SignalP 4.1數據庫（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和NCBI數據庫的保守結構域數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）分別預測PdLYZ蛋白的信號肽和結構域。PdLYZ蛋白和其他生物溶菌酶的多序列比對通過ClustalX軟件完成，然后通過多序列對比顯示工具（http://www.bio-soft.net/sms/index.html）進行可視化展示。PdLYZ蛋白和其他溶菌酶的進化分析利用MEGA-X軟件中的鄰接法（ neighbor-joining，NJ）完成，節點上的數字表示1 000次復制的自展值，用于檢驗進化樹分支的可信度。

1.5 PdLYZ重組蛋白的表達、純化和復性以pMD19-T-PdLYZ質粒作為模板，并使用特異性引物PdLYZ_F和PdLYZ_R擴增編碼PdLYZ成熟肽的序列，將擴增的PdLYZ成熟肽插入pEASY-E1表達載體中，然后將構建好的重組質粒pEASY-E1-PdLYZ轉化至Trans BL21（DE3）pLysS化學感受態細胞中。挑選陽性單克隆菌落接種到200 mL含氨芐青霉素（100 g·L-1）的盧里亞-貝爾塔尼培養基（LB培養基）培養至OD600約0.6，并添加異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG）（終濃度1 mmol L-1）誘導PdLYZ重組蛋白表達。離心、收集菌細胞進行超聲破碎（工作5 s，間隙20 s，功率200 W），破碎至菌液澄清后，12 000 r·min-14 ℃下離心30 min，收集上清液用于蛋白純化。

采用鎳瓊脂糖凝膠FF對帶有His標簽的PdLYZ重組蛋白進行純化，將純化后的PdLYZ蛋白裝入透析袋中，在4 ℃條件下依次用含有8、6、4、2、1、0 mol· L-1的尿素透析液（50 mmol· L-1Tris，50 mmol· L-1NaCl，1 mmol· L-1EDTA-2Na，1 mmol ·L-1還原型谷胱甘肽，2 mmol· L-1氧化型谷胱甘肽，133 mmol· L-1甘氨酸）中進行復性。通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）檢驗PdLYZ重組蛋白的表達，純化和復性結果。最后，參考BCA快速蛋白定量試劑盒說明書測定 PdLYZ重組蛋白的濃度。

1.6 PdLYZ重組蛋白對大腸桿菌和變異鏈球菌抑菌活性的測定PdLYZ重組蛋白對大腸桿菌和變異鏈球菌抑菌活性的測定參考ZHOU Z等[21]的方法并稍有修改。將供試菌（大腸桿菌和變異鏈球菌）在37 ℃200 r·min-1下培養至對數生長期，再將對數生長期的供試菌菌液在10 000 g 4 ℃下離心15 min收集細胞，將收集的細胞用PBS緩沖液洗2次后重懸至菌濃度為104cfu ·mL-1，取50 μL菌液，加入250 μL PdLYZ重組蛋白，混勻后37 ℃孵育0.5 h，采用等濃度的牛血清蛋白（BSA蛋白）作為對照。然后取20 μL混合液加入200 μL培養基（大腸桿菌：LB培養基；變異鏈球菌：腦心浸出液肉湯（BHI）培養基），37 ℃ 200 r·min-1培 養，每隔1 h在600 nm處測定吸光度的變化。

1.7 PdLYZ重組蛋白在不同溫度下對溶珊瑚弧菌抑制活性的測定溶珊瑚弧菌26 ℃ 200 r·min-1培養至對數生長期，按照1.6部分的方法獲取PdLYZ重組蛋白和溶珊瑚弧菌共孵育的菌液，然后取20 μL混合液加入200 μL 2216E液體培養基，分別于26 ℃和37 ℃下200 r·min-1培養，每隔1 h在600 nm處測 定吸光度的變化。

2 結果與分析

2.1 PdLYZ基因的分子特征PdLYZ的開放閱讀框長648 bp，編碼215個氨基酸。利用SignalP 4.1數據庫預測PdLYZ推導蛋白的N末端有23個氨基酸殘基組成的信號肽。NCBI-CDD保守結構分析結果表明，PdLYZ蛋白含有1個類溶菌酶超家族結構域（Ile31-Gly214）。ExPASy數據庫分析結果揭示PdLYZ成熟肽的分子量標準和理論等電點分別為22.05 kDa和8.84。

多序列比對的結果顯示，PdLYZ與萼柱珊瑚（Stylophora pistillata）中的溶菌酶（XP_022779194.1）有41.47%的相似性；與指狀鹿角珊瑚（Acropora digitifera）中的溶菌酶（XP_015770608.1）有43.33%的相似性；與海綿Amphimedon queenslandica的溶菌酶（XP_011407575.1）具有30.65%相似性。上述4種生物溶 菌酶序列的多重比較共揭示5個保守的半胱氨酸（Cys26，Cys41，Cys116，Cys197，Cys204）（圖1）。

圖1 PdLYZ序列與其他生物溶菌酶序列比對結果Fig. 1 Multiple alignment of PdLYZ amino acid sequence with that of other animals in GenBank.Sp：柱狀珊瑚Stylophora pistillata ; Ad：鹿角珊瑚Acropora digitifera; Pd：杯形珊瑚Pocillopora damicornis; Aq：海綿Amphimedon queenslandica。*代表保守的半胱氨酸。The asterisk below indicates conserved cysteine residues.

2.2 PdLYZ蛋白的進化分析基于PdLYZ蛋白的氨基酸序列采用Blastp檢索NCBI中的Genbank數據庫中的同源蛋白，發現PdLYZ蛋白與其他無脊椎動物的溶菌酶相似性為30.65%～44.78%；與細菌和藻類的溶菌酶相似性為25.54%～49.15%。其中與細菌Gammaproteobacteria bacterium（RKZ98632.1）的溶

菌酶相似性最高，達49.15%。利用MEGA-X軟件的NJ方法構建了系統進化樹（圖2）。在進化樹中，PdLYZ首先和珊瑚、海綿的溶菌酶聚成一支，而細菌、藻和貝類的溶菌酶則聚成另一個獨立的分 支。

圖2 不同生物溶菌酶的系統進化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of lysozymes from different organismsSp：柱狀珊瑚Stylophora pistillata; Of：星珊瑚Orbicella faveolate; Am：鹿 角 珊 瑚Acropora millepora; Nv：?？鸑ematostella vectensis; Ed：?？鸈xaiptasia diaphana; At：海葵Actinia tenebrosa; Dg：軟珊瑚 Dendronephthya gigantea;Ta：錦蟾Thalassophryne amazonica; Sf：硬骨舌魚Scler opages formosus; Gm：鱈魚Gadus morhua.

2.3 PdLYZ重組蛋白的表達與純化為了進一步揭示PdLYZ在鹿角杯形珊瑚中的生物學功能，利用IPTG誘導已轉化重組質粒pEASY-E1-PdLYZ的E.coliBL21（DE3）感受態細胞表達PdLYZ重組蛋白。采用鎳柱純化體外表達的PdLYZ重組蛋白，SDS-PAGE分析結果表明，PdLYZ分子量為22.05 kDa（圖3），與ExPASy數據庫預測的蛋白相對分子量一致。測定純化透析后的PdLYZ重組蛋白 濃度為0.1 g·L-1。

圖3 PdLYZ重組蛋白的表達與純化M：蛋白marker；1：未誘導組蛋白的表達；2：誘導組蛋白的表達；3：鎳柱純化后的PdLYZ蛋白。Fig. 3 SDS-PAGE analysis of recombinant PdLYZ protein.Lane M: protein molecular weight marker. Lane 1: protein expression of control group, not induced; Lane 2: protein expression of induced group; Lane 3: PdLYZ protein purified by Ni2+ chelating Sepharose colum.

2.4 PdLYZ重組蛋白對大腸桿菌和變異鏈球菌的抑制活性 在37 ℃下，PdLYZ重組蛋白能抑制大腸桿菌（革蘭氏陰性菌）和變異鏈球菌（革蘭氏陽性菌）的生長。PdLYZ重組蛋白在3、4 h能顯著抑制大腸桿菌的生長，抑制率分別為49.48%和22.46%（圖4）。PdLYZ重組蛋白在3、4 h能顯著抑制變異鏈球菌的生長，抑制率分別為53.64%和26.45%（圖5）。

圖4 PdLYZ重組蛋白對大腸桿菌的抑菌活性，rLYZ：PdLYZ重組蛋白；BSA：牛血清蛋白（CK）。數據以平均值±標準差表示（n=3），*代表顯著性差異（P＜0.05）。Fig. 4 Inhibitory activity of recombinant PdLYZ protein against Escherichia coli.rLYZ: recombinant PdLYZ protein; BSA：bovine serum albumin (CK). Values are presented as the mean ± SD (n=3), and* represents significant difference (P ＜ 0.05).

圖5 PdLYZ重組蛋白對變異鏈球菌的抑菌活性，rLYZ：PdLYZ重組蛋白；BSA：牛血清蛋白（CK）。數據以平均值±標準差表示（n=3），*代表顯著性差異（P＜0.05）。Fig. 5 Inhibitory activity of recombinant PdLYZ protein against Streptococcus mutansi.rLYZ: recombinant PdLYZ protein; BSA: bovine serum albumin (CK). Values are presented as the mean ± SD (n=3), and* represents significant difference (P＜0.05).

2.5 不同溫度下PdLYZ重組蛋白對溶珊瑚弧菌的抑制活性在26 ℃和32 ℃下測定了PdLYZ重組蛋白對溶珊瑚弧菌生長的抑制活性。PdLYZ重組蛋白在2種溫度下均能顯著抑制溶珊瑚弧菌生長。26 ℃時PdLYZ重組蛋白在7 h對溶珊瑚弧菌生長的抑制率高達70.50%（P＜0.05），32 ℃時PdLYZ重組蛋白在 6 h對溶珊瑚弧菌生長的抑制率達47.93%（圖6）。

圖6 在26 ℃和32 ℃下，PdLYZ重組蛋白對溶珊瑚弧菌的抑菌活性rLYZ：PdLYZ重組蛋白；BSA：牛血清蛋白（CK）。數據以平均值±標準差表示（n=3），*代表顯著性差異（P＜0.05）。Fig. 6 Inhibitory activity of recombinant PdLYZ protein against Vibrio coralliilyticus at 26 ℃ and 32 ℃.rLYZ: recombinant PdLYZ protein; BSA：bovine serum albumin (CK). Values are presented as the mean ± SD (n=3),and * represents significant difference (P＜0.05).

3 討 論

病原菌導致的珊瑚疾病對珊瑚礁生態系統造成的影響不容小覷，尤其是在全球氣候不斷變暖的背景下。溶菌酶是廣泛存在于各種生物的一類抗菌分子，在無脊椎動物固有免疫應答中發揮著重要作用。本實驗探究了鹿角杯形珊瑚溶菌酶的分子特征及其生物學功能，揭示了溶菌酶可能參與珊瑚免疫應答。鹿角杯形珊瑚溶菌酶PdLYZ基因的cDNA開放閱讀框長648 bp，編碼215個氨基酸，其序列與其他生物的溶菌酶相似性為25.54%～49.15%。鹿角杯形珊瑚溶菌酶PdLYZ推導蛋白的N末端有1條由23個氨基酸殘基組成的信號肽，表明PdLYZ蛋白分泌到細胞外行使功能。此外，鹿角杯形珊瑚溶菌酶PdLYZ含有1個類溶菌酶超家族的結構域，該結構域對于溶菌酶的抑菌功能可能至關重要。MEGA軟件構建鹿角杯形珊瑚溶菌酶PdLYZ和其他生物溶菌酶的系統進化樹的分析結果表明，鹿角杯形珊瑚溶菌酶PdLYZ和珊瑚、海綿的溶菌酶聚成1支，而細菌、藻和貝類的溶菌酶則聚成另外1個獨立的分支；系統進化樹的分析結果表明，鹿角杯形珊瑚溶菌酶PdLYZ是溶菌酶在鹿角杯形珊瑚中的同源酶，而且它可能擁有與其他動物中的同源酶相似的生物學活性。

造礁石珊瑚健康菌群的維持與珊瑚礁生態系統的健康密切相關。為探究溶菌酶在珊瑚免疫應答中的可能作用，本研究測定了鹿角杯形珊瑚溶菌酶PdLYZ重組蛋白對革蘭氏陽性菌變異鏈球菌、革蘭氏陰性菌大腸桿菌和病原菌溶珊瑚弧菌的抑制活性。結果表明，鹿角杯形珊瑚溶菌酶PdLYZ重組蛋白對變異鏈球菌和大腸桿菌的生長均有顯著的抑制作用。PdLYZ重組蛋白可能通過破壞變異鏈球菌的細胞壁結構，即催化水解細胞壁中N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之間形成的β-1，4糖苷鍵[22]，來抑制變異鏈球菌的生長。對于大腸桿菌和溶珊瑚弧菌而言，PdLYZ重組蛋白可能通過與脂多糖（LPS）的結合活性發揮抑菌作用[23]。相似的報道已證明海參、蟹、蝦和貝等無脊椎動物中的溶菌酶也對革蘭氏陽性菌和陰性菌均具有抑制作用[9,24-26]。海洋無脊椎動物的溶菌酶可能比陸地無脊椎動物的活性范圍更廣，便于應對復雜海洋環境中多樣性更高的病原菌[27]。PdLYZ重組蛋白廣泛的抑菌活性表明溶菌酶可能參與珊瑚機體的防御免疫。

溶珊瑚弧菌是一種廣為報道的珊瑚病原菌，海水升溫會加劇溶珊瑚弧菌對珊瑚的致病力[28]。為探究溶菌酶在珊瑚應對未來全球氣候變暖中的可能作用，本研究測定了與PdLYZ重組蛋白（實驗組）或BSA蛋白（對照組）共孵育后，溶珊瑚弧菌在26 ℃和32 ℃下的生長曲線。結果表明，高溫會加速溶珊瑚弧菌的生長，病原菌的快速生長可能觸發珊瑚固有免疫應答，溶菌酶作為固有免疫的關鍵組成部分，通常被認為是抵抗病原菌感染的第一道防線。本研究結果表明，PdLYZ重組蛋白在常溫及高溫條件下能顯著抑制溶珊瑚弧菌的生長，且其抑菌能力在高溫條件下更強。這與在其他生物中的研究一致，STABILI[17]研究結果表明，?？鸄. equina粘液中類溶菌酶的抑菌活性在高溫條件下較強，黃金鳳等[29]研究結果表明，松浦鏡鯉幼魚溶菌酶活性隨溫度升高而顯著增加。此外，PdLYZ重組蛋白在高溫條件下會在前期顯著抑制病原菌生長。這些結果表明，PdLYZ蛋白對于鹿角杯形珊瑚在未來氣候變暖中可能會降低病原菌的數量和比例，對抑制珊瑚疾病的爆發具有重要意義。綜上所述，本研究克隆得到一個鹿角杯形珊瑚的溶菌酶基因，其蛋白含有類溶菌酶超家族結構域，其重組蛋白對于大腸桿菌、變異鏈球菌和溶珊瑚弧菌均具有抑制作用，且在高溫條件下會在前期顯著抑制溶珊瑚弧菌的生長。由此筆者推測溶菌酶在珊瑚免疫應答中可能扮演著重要作用。