不同干熱處理對(duì)西瓜種子帶菌量的研究

李 曼

（河北省衡水市武邑縣職教中心，河北 衡水 053400）

1.材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試西瓜種子

“懶漢地瓜王”西瓜種子，千瑞種業(yè)公司生產(chǎn)。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

NA培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂an20g，1000ml水；NB培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，1000ml水。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

滅菌鍋SQ810C、恒溫培養(yǎng)箱BSG-250、搖床HNY-2102C、干燥箱DZF-6090

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 西瓜種子的處理

采用干熱處理法將種子在陽(yáng)光下暴曬，使其充分干燥，然后在恒溫干燥箱內(nèi)進(jìn)行處理。準(zhǔn)備3個(gè)干燥箱，設(shè)65℃，70℃，75℃ 3個(gè)溫度處理。每處理3次重復(fù)，每重復(fù)3粒種子。將種子置于滅菌培養(yǎng)皿中，干燥箱內(nèi)烘干24h。對(duì)照（CK）為不經(jīng)過(guò)干熱處理的種子。

1.3.2 培養(yǎng)基的選擇

采用了水和NB培養(yǎng)液兩種培養(yǎng)液對(duì)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了研究，用平板涂布法對(duì)兩種培養(yǎng)液培養(yǎng)出的菌落進(jìn)行了比較實(shí)驗(yàn)。根據(jù)得出的結(jié)果，在正式實(shí)驗(yàn)中選用NB培養(yǎng)基更加合理，確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和嚴(yán)謹(jǐn)性。

1.3.3 菌懸液的培養(yǎng)

NA和NB培養(yǎng)基的配制方法是將幾種物質(zhì)分別稱量后放入1000 ml燒杯中，按比例加水、定容、攪勻、分裝，放入121℃高壓滅菌鍋中滅菌15 min。干熱處理后的種子在超凈工作臺(tái)中接到滅好菌的三角瓶中，超凈作臺(tái)紫外線滅菌15分鐘，滅菌結(jié)束后吹風(fēng)10分鐘左右后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。采用振蕩培養(yǎng)法將不同溫度干熱處理后的種子加入到滅菌的NB培養(yǎng)液中，160 rpm的搖床中振蕩培養(yǎng)24 h。

1.3.4 西瓜種子帶菌量的測(cè)定

將滅菌凝固后的NA培養(yǎng)液在微波爐內(nèi)加熱，直至呈液態(tài)。在超凈工作臺(tái)中倒入培養(yǎng)皿中。然后吸取1 ml菌懸液依次稀釋10-1、10-2、10-3、10-4和10-5倍。再?gòu)?0-3、10-4、10-5的稀釋液中取100 μL在培養(yǎng)基上涂板，用三角玻璃環(huán)涂勻。每個(gè)處理3皿。以未進(jìn)行干熱處理的種子作為對(duì)照。

待涂好板的培養(yǎng)基表面風(fēng)干后，倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)24 h，觀察并用活細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2007軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行整理作圖，并將得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 22.0進(jìn)行分析。

2.結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基質(zhì)的測(cè)定結(jié)果

為了保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和嚴(yán)謹(jǐn)性，我們采用了以水和NB培養(yǎng)液兩種培養(yǎng)液對(duì)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了研究，用平板涂布法對(duì)兩種培養(yǎng)液培養(yǎng)出的菌落進(jìn)行了比較實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3-1所示。

圖3 -1 選擇培養(yǎng)液對(duì)照

從兩種培養(yǎng)液的成分來(lái)看，其中NB培養(yǎng)液含有牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉，營(yíng)養(yǎng)成分相對(duì)較多，為菌落生長(zhǎng)提供了較好的環(huán)境；而以水作為培養(yǎng)液，沒(méi)有營(yíng)養(yǎng)成分，菌落生長(zhǎng)緩慢。得出的結(jié)果顯而易見(jiàn)，NB培養(yǎng)液生長(zhǎng)出來(lái)的菌落非常多，而水培養(yǎng)出來(lái)的菌落比較稀少。綜上，NB培養(yǎng)液是適合本實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)液，但是菌落數(shù)量龐大，需要對(duì)菌懸液進(jìn)行更大的倍比稀釋，保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

2.2 不同溫度干熱處理下對(duì)種子帶菌量的測(cè)定

在預(yù)備實(shí)驗(yàn)中，我們選擇了10-1、10-2、10-3，得到的細(xì)菌菌落非常多，難以統(tǒng)計(jì)。二次實(shí)驗(yàn)，在制備菌懸液時(shí)沒(méi)有選用培養(yǎng)液培養(yǎng)，雖然滅菌率顯著，但是得到的結(jié)果沒(méi)有對(duì)比性。在我們不斷的測(cè)試中，選擇了在制備菌懸液時(shí)選擇NB培養(yǎng)液，然后選擇10-3、10-4、10-5的稀釋液。得到的數(shù)據(jù)如表：

如表3-1所示，65℃、70℃和75℃各個(gè)溫度下的10-3、10-4、10-5三個(gè)濃度梯度細(xì)菌數(shù)量由低到高成一定的倍比關(guān)系，符合實(shí)驗(yàn)結(jié)果的發(fā)展規(guī)律；同一濃度下，各個(gè)溫度梯度細(xì)菌的數(shù)量差異性也非常顯著。

表3-1 處理后種子帶菌數(shù)量

在65℃ 24 h干熱處理下，西瓜種子帶菌量還較高，與對(duì)照相比，滅菌率57%；在70℃ 24 h干熱處理溫度下，西瓜種子帶菌量顯著降低，滅菌率80%；在75℃ 24 h干熱處理溫度下，西瓜種子滅菌已經(jīng)非常明顯，滅菌率高達(dá)95%。

以10-5為例，用SPSS22.0做方差分析，結(jié)果如下表：

以10-5濃度做方差分析研究不同干熱處理對(duì)西瓜種子帶菌量影響的結(jié)果表明，如表3-2所示：65℃，70℃和75℃的處理和對(duì)照比較均有顯著性差異，同一時(shí)間下三個(gè)溫度的干熱處理對(duì)西瓜種子帶菌量均有不同程度的影響。

表3-2 10-5濃度下菌落個(gè)數(shù)分析

其中75℃ 24 h干熱處理溫度對(duì)西瓜種子帶菌量抑制效果最顯著，平均細(xì)菌數(shù)量33個(gè)。其次是70℃ 24 h對(duì)其的抑制效果，平均細(xì)菌數(shù)量165個(gè)。與對(duì)照組相比效果最差的是65℃ 24 h的處理，其平均細(xì)菌數(shù)量還存在467個(gè)。

帶菌量檢測(cè)結(jié)果表明，同一時(shí)間下不同溫度組合干熱處理對(duì)種子表面病菌的滅菌率明顯，隨著干熱處理溫度升高，滅菌率明顯增加，帶菌量下降。表明西瓜種子帶菌量隨著干熱處理溫度升高呈顯著降低趨勢(shì)。

3.結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

由上面得到的結(jié)果表明：“懶漢地瓜王”西瓜種子經(jīng)NB培養(yǎng)液培養(yǎng)后，干熱處理對(duì)西瓜種子的滅菌率明顯。隨著干熱處理溫度升高，滅菌率明顯。65℃，70℃和75℃三個(gè)處理溫度的滅菌率分別是57%、80%和95%。所以，在實(shí)際生產(chǎn)中，75℃ 24 h的干熱處理是最適宜西瓜種子的處理。本實(shí)驗(yàn)為干熱處理廣泛應(yīng)用在減少西瓜種子帶菌量提供了一些理論依據(jù)。

3.2 討論

現(xiàn)有選擇的培養(yǎng)基在種子實(shí)際帶菌量較低的情況下，由于培養(yǎng)基的靈敏度有限或?qū)嶒?yàn)不規(guī)范導(dǎo)致培養(yǎng)基上長(zhǎng)出來(lái)的全部是假陽(yáng)性菌落，常?？赡軐?dǎo)致檢測(cè)不到真實(shí)的病菌，導(dǎo)致錯(cuò)誤檢測(cè)結(jié)果。所以注意自身安全，規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作，減少實(shí)驗(yàn)誤差。在研究中發(fā)現(xiàn)控制和消除病害的早期污染源是預(yù)防植物病害的關(guān)鍵技術(shù)，但目前還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)發(fā)生西瓜病害的流行規(guī)律、病害的早期污染源等。有研究結(jié)果表明，由于感染病菌的主要原因是接種源是感染病菌的種子。但是，關(guān)于病菌的種子的帶菌機(jī)制的研究還沒(méi)有完善，通過(guò)什么方法處理帶菌的種子是最有效的，這些都是生產(chǎn)上待解決的問(wèn)題。

今后西瓜的重要種傳病害研究方向集中于以下幾個(gè)方面：深入了解種子如何感染病菌、病菌的種子傳播和生存機(jī)制，有助于完善種子檢測(cè)的規(guī)程和處理種子的技術(shù)?，F(xiàn)在的檢測(cè)方法在應(yīng)用中各有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，發(fā)展快速、準(zhǔn)確的可以確認(rèn)病菌的活力的高質(zhì)量檢測(cè)方法；在種子處理中，找到能夠提高種子的活力和易于操作、普及的方法同時(shí)有效地去除西瓜種子內(nèi)部的病菌；建立完善的種子采后保存處理規(guī)程。